ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE PCR PARA LA DETECCIÓN DE LA SECUENCIA ITS1 DE NECATOR AMERICANUS (STILES, 1902) Y CLONACIÓN DEL PRODUCTO PARA SU USO COMO CONTROL

Resumo

La anquilostomiasis generalmente se produce por Necator americanus (Stiles, 1902), y ocasiona síntomas digestivos y anemia. El diagnóstico por coprología tiene sensibilidad baja en las cargas parasitarias leves. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica sensible y específica, que debe ser adaptada a las condiciones de laboratorio, donde se necesitan controles positivos. El objetivo de este trabajo fue la estandarización de la técnica de PCR para la amplificación de la secuencia ITS-1 de N. americanus en muestras de heces y su clonación para el uso como control. Se estandarizaron tres protocolos de extracción de ADN (Fenol/cloroformo, Precipitación salina, y Resina Chelex® 100). Se determinaron las concentraciones óptimas de reactivos (MgCl , BSA, dNTP, cebadores, y Taq polimerasa), así como, la 2 temperatura de hibridación y número de ciclos. Se determinó la sensibilidad y especificidad analítica de la técnica. Para la clonación, la secuencia ITS-1 amplificada por PCR, se purificó y se ligó con el vector pGEM-T-Easy. Se transformaron células competentes E. coli XL1Blue MRF` con la mezcla de ligación (pGEM-T-easy-Na-ITS1), se identificaron las colonias recombinantes y luego se extrajo el ADN plasmídico. El mejor protocolo de extracción de ADN fue el fenol/cloroformo, las condiciones óptimas de la PCR fueron; MgCl 1,5 mM, BSA 0,5 mg/mL, dNTP 100 μM, cebadores 0,6 μM, y Taq polimerasa 1 U, 2 56 °C de temperatura de hibridación y 40 ciclos. Las cantidades óptimas determinadas de los reactivos permitieron ahorro de los mismos. Se obtuvo 100% de especificidad y una sensibilidad analítica de 10 pg de ADN (extraído de muestras de heces) y 10 ag del plásmido (con la secuencia clonada), que funcionó como control positivo.