ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE PCR PARA LA DETECCIÓN DE LA SECUENCIA ITS1 DE NECATOR AMERICANUS (STILES, 1902) Y CLONACIÓN DEL PRODUCTO PARA SU USO COMO CONTROL

Autores/as

  • Alberto Frango-Ramos Instituto de Investigaciones Biomédicas “Dr. Francisco J. Triana Alonso” (BIOMED) y Departamento de Parasitología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo Sede Aragua, Venezuela.
  • Ronaldo Delgado Instituto de Investigaciones Biomédicas “Dr. Francisco J. Triana Alonso” (BIOMED) y Departamento de Parasitología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo Sede Aragua, Venezuela.
  • Emily Catalano-Donaire Instituto de Investigaciones Biomédicas “Dr. Francisco J. Triana Alonso” (BIOMED) y Departamento de Parasitología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo Sede Aragua, Venezuela.
  • Jhon Jesús- Arzapalo Departamento de Parasitología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo Sede Carabobo, Venezuela.
  • Renzo Nino Incani-Cotognini Departamento de Parasitología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo Sede Carabobo, Venezuela.
  • María Jesús Perteguer-Prieto Instituto de Salud Carlos III, Centro Nacional de Microbiología, Servicio de Parasitología, Majadahonda, Madrid, España.
  • Elizabeth Ferrer-Jesús Instituto de Investigaciones Biomédicas “Dr. Francisco J. Triana Alonso” (BIOMED) y Departamento de Parasitología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo Sede Aragua, Venezuela.

DOI:

https://doi.org/10.24039/rnh20211521197

Palabras clave:

Clonación, Diagnóstico, Estandarización, ITS-1, Necator americanus, PCR

Resumen

La anquilostomiasis generalmente se produce por Necator americanus (Stiles, 1902), y ocasiona síntomas digestivos y anemia. El diagnóstico por coprología tiene sensibilidad baja en las cargas parasitarias leves. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica sensible y específica, que debe ser adaptada a las condiciones de laboratorio, donde se necesitan controles positivos. El objetivo de este trabajo fue la estandarización de la técnica de PCR para la amplificación de la secuencia ITS-1 de N. americanus en muestras de heces y su clonación para el uso como control. Se estandarizaron tres protocolos de extracción de ADN (Fenol/cloroformo, Precipitación salina, y Resina Chelex® 100). Se determinaron las concentraciones óptimas de reactivos (MgCl2, BSA, dNTP, cebadores, y Taq polimerasa), así como, la temperatura de hibridación y número de ciclos. Se determinó la sensibilidad y especificidad analítica de la técnica. Para la clonación, la secuencia ITS-1 amplificada por PCR, se purificó y se ligó con el vector pGEM-T-Easy. Se transformaron células competentes E. coli XL1Blue MRF` con la mezcla de ligación (pGEM-T-easy-Na-ITS1), e identificaron las colonias recombinantes y luego se extrajo el ADN plasmídico. El mejor protocolo de extracción de ADN fue el fenol/cloroformo, las condiciones óptimas de la PCR fueron; MgCl2 1,5 mM, BSA 0,5 mg/mL, dNTP 100 µM, cebadores 0,6 µM, y Taq polimerasa 1 U, 56 °C de temperatura de hibridación y 40 ciclos. Las cantidades óptimas determinadas de los reactivos permitieron ahorro de los mismos. Se obtuvo 100% de especificidad y una sensibilidad analítica de 10 pg de ADN (extraído de muestras de heces) y 10 fg del plásmido (con la secuencia clonada), que funcionó como control positivo.

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Publicado

2021-08-27

Cómo citar

Frango-Ramos, A. ., Delgado, R. ., Catalano-Donaire, E. ., Arzapalo, J. J.-., Incani-Cotognini, R. N. ., Perteguer-Prieto, M. J. ., & Ferrer-Jesús, E. . (2021). ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE PCR PARA LA DETECCIÓN DE LA SECUENCIA ITS1 DE NECATOR AMERICANUS (STILES, 1902) Y CLONACIÓN DEL PRODUCTO PARA SU USO COMO CONTROL. Neotropical Helminthology, 15(2). https://doi.org/10.24039/rnh20211521197