1 The Biologist (Lima), 2023, vol. 21 (1), XX- XX.
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DOI: https:/ /doi.org/10.24039/rtb20232111533
4 Este artículo es publicado por la revista The Biologist (Lima) de la Facultad de Ciencias Naturales y Matemática, Universidad
5 Nacional Federico Villarreal, Lima, Perú. Este es un artículo de acceso abierto, distribuido bajo los términos de la licencia Creative
6 Commons Atribución 4.0 Internacional (CC BY 4.0) [https:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/deed.es] que permite el uso,
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distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada de su fuente original.
9 ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL
10 COMPARISON OF TWO STAINING METHODS FOR THE DETECTION OF NUCLEOLAR
11 ORGANIZING REGIONS (NOR) OF ACROCENTRIC CHROMOSOMES
12 COMPARACIÓN DE DOS MÉTODOS DE TINCIÓN PARA LA DETECCIÓN DE
13 REGIONES ORGANIZADORAS NUCLEOLARES (NOR) DE CROMOSOMAS
14 ACROCÉNTRICOS
15 Berioska Rosas-Cartolin1* & Ismenia Gamboa-Oré 2
16 1Universidad Nacional Federico Villarreal (UNFV), Lima, Perú.
17 2Instituto Nacional Materno Perinatal (INMP), Lima, Perú.
18 *Corresponding author: berioska.biologia@gmail.com
19 Titulillo: Two staining methods for the detection of Nucleolar Organizing Regions
20 Rosas-Cartolin & Gamboa- Oré
21 Berioska Rosas-Cartolin: https://orcid.org/0000-0003-2284- 0994
22
23
Ismenia Gamboa- Oré:
https://orcid.org/0000-0002-1664- 8843
24 ABSTRACT
25 This study aimed to compare two staining methods for detecting nucleolar organizing regions
26 (NOR) of acrocentric chromosomes in the Cytogenetics Laboratory of INMP (“Instituto Nacional
27 Materno Perinatal”), Lima, Peru. Atotal of 60 metaphases with normal karyotypes were analyzed,
28 of which 30 were stained for each method: Kodama et al. and Howell & Black, respectively. The
29 recognition efficiency and staining intensity of these regions was evaluated by each technique
30 based on the count of NORs Ag (+); Likewise, the staining and integrity of the chromosomes were
31 evaluated and the differences between these two methods were established. No significant
32 differences were found regarding the number of stained regions with both techniques; however, in
33 staining intensity and chromosomal quality, the Howell & Black method was superior. It is
34 concluded that the Howell & Black method generates better results for the cytogenetic analysis of
35 these regions.
36
37
Keywords: cytogenetics – heteromorphisms – NOR - satellites
38 RESUMEN
39 El objetivo de este estudio fue comparar dos métodos de tinción para la detección de regiones
40 organizadoras nucleolares (NOR) de los cromosomas acrocéntricos en el Laboratorio de
41 Citogenética del INMP (Instituto Nacional Materno Perinatal), Lima, Perú. Se analizó un total de
42 60 metafases con cariotipos normales, de las cuales 30 fueron teñidas para cada método: Kodama
43 et al. y Howell & Black, respectivamente. Se evaluó la eficacia de reconocimiento e intensidad
44 de tinción de estas regiones por cada método en función a la contabilización de NORs Ag (+);
45 asimismo se evaluó la tinción e integridad de los cromosomas y se estableció las diferencias ent re
46 estos dos métodos. No se encontraron diferencias significativas en cuanto al número de regiones
47 teñidas con ambos métodos; sin embargo, en la intensidad de tinción y calidad cromosómica el
48 método de Howell & Black fue superior. Se concluye que el método de Howell & Black genera
49 mejores resultados para el análisis citogenético de estas regiones.
50 Palabras claves: citogenética – heteromorfismos – NOR – satélites
51
52 I NTRODUCCIÓN
53 Una parte importante del origen de problemas de fertilidad y abortos espontáneos
54 recurrentes en parejas están relacionadas con la presencia de variantes heteromórficas halladas en
55 los cromosomas observados en varias investigaciones (Madon et al., 2005; De La Fuente et al. ,
56 2009; Akbaş et al., 2012; Cheng et al., 2017; Dai et al., 2018 ).
57 Las variantes heteromórficas se relacionan a diferencias en el tamaño de segmentos
58 cromosómicos; por ejemplo, el incremento o disminución de la longitud del satélite en el brazo
59 corto o en la longitud del tallo del brazo corto en los cromosomas acrocéntricos; asimismo, se han
60 relacionado una mayor frecuencia de casos de satélites muy grandes en hombres infértiles y adultos
61 con fallas reproductivas (Madon et al., 2005; De La Fuente et al., 2009; Akbaş et al., 2012; Cheng
62 et al., 2017; Dai et al., 2018; McGowan-Jordan et al., 2020 ).
63 Estos heteromorfismos citogenéticos son detectados comúnmente con la técnica de tinción
64 estándar (bandas G); sin embargo, en muchos estudios publicados se recomienda la utilización de
65 técnicas de tinción diferenciales como bandas C, NOR, etc. (Madon et al., 2005; De la Fuente et
66 al., 2009; Radhakrishnan et al., 2010; Akbaş et al., 2012; Dong et al., 2013; Surech et al., 2016 ;
67 Zhu et al., 2019 ).
68 La técnica de tinción NOR (regiones organizadoras nucleolares) permite la detección de
69 estas variantes mediante la visualización de manchas oscuras debido a que estas regiones están
70 localizadas en los tallos y satélites de los cromosomas acrocéntricos además de que se utiliza
71 nitrato de plata, la cual tiene alta afinidad por los genes ribosómicos para la síntesis de ARN
72 ribosomal presentes en estas regiones (Hernando, 2005). Esta técnica presenta varios protocolos ,
73 pero hay dos en particular que se utilizaron para cromosomas humanos y tienen una metodología
74 manejable, las cuales son de Kodama et al. (1980) y Howell & Black (1980). La diferencia entre
75 estas dos radica en que la segunda utiliza un protector coloidal.
76 En el Perú no se han registrado estudios acerca de la implementación y aplicación de esta
77 técnica para la detección de estos satélites en pacientes, además en el Laboratorio de Citogenética
78 del INMP (“Instituto Nacional Materno Perinatal”), no se aplica esta metodología.
79 El objetivo del presente estudio fue comparar dos métodos de tinción para la detección de
80
81
NOR de cromosomas acrocéntricos en el Laboratorio de Citogenética – INMP, Lima, Perú.
82 MATERIAL Y MÉTODOS
83 El estudio se realizo en 60 células metafásicas provenientes de cultivos de linfocitos de
84 sangre periférica provenientes de pacientes derivados al Laboratorio de Citogenética del INMP
85 durante el período de setiembre y octubre del 2019 con cariotipo normal. Fueron distribuidas 30
86 para cada método de tinción. En cuando a la tinción NOR, se describe en forma resumida la
87 preparación de los diferentes métodos y sus respectivas modificaciones:
88 Método de Kodama et al. (1976)
89 Se colocaron ocho gotas de Nitrato de Plata al 50% sobre la lámina que contenía el preparado
90 cromosómico. Luego, se incubó en cámara húmeda y oscura en estufa por tres h a 60°C para
91 posteriormente lavar enérgicamente con agua destilada y dejar secar a temperatura ambiente .
92 Método de Howell & Black (1980)
93 Se colocaron gotas separadas de la solución de gelatina al 2% más ácido fórmico sobre la lámina
94 que contenía el preparado cromosómico. Luego, se añadió sobre cada gota de la solución
95 mencionada, dos gotas de Nitrato de Plata al 50% para luego homogenizar la mezcla suavemente
96 con dos cubreobjetos colocándolo sobre una placa Petri e incubando en Baño María a 60°C por
97 cinco min chequeando hasta conseguir una coloración dorado café. Se lavó la lámina con agua
98 destilada enérgicamente hasta retirar los cubreobjetos y se dejó secar a temperatura ambiente .
99 Para cada método, posteriormente, se coloreo las láminas con el protocolo de tinción GTG
100 (Giemsa-Tripsina-Giemsa) del Laboratorio de Citogenética del INMP.
101 Para evaluar la presencia de los NORs, se evaluaron las metafases al azar, leyendo la lámina
102 de cada muestra en zig-zag. Cada metafase se identificó a un aumento de 20X y posteriormente se
103 evaluó solo a los cromosomas acrocéntricos a 100X utilizando los criterios de Sotelo (1982): para
104 el conteo de los NORs se tomó en cuenta sólo la presencia o ausencia a la reacción a la plata, sin
105 importar la forma del depósito sobre la región de los organizadores nucleolares. Si la positividad
106 a la plata existió en al menos una metafase, se tomó como metafase Ag (+), contando cada
107 cromosoma acrocéntrico como unidad. El número mínimo de NORs Ag (+) por metafase sería de
108 uno, y el máximo posible de 10.
109 Se utilizó la prueba de T student en el programa estadístico R (versión 3.6.0, año 2019) ,
110 con el objetivo de realizar comparación de medias y establecer si hay diferencias significativas en
111 los resultados de los dos métodos aplicados.
112 Aspectos éticos: Esta investigación no requirió de consentimientos informados debido a que no se
113 utilizó datos personales que comprometan la confidencialidad del paciente (ejemplo: nombres,
114 dirección, teléfono, etc), asimismo no generó ningún riesgo debido a que solo se limitó a analizar
115
116
las metafases con la tinción implicada.
117 RESULTADOS
118 Se analizaron un total de 60 metafases; 30 obtenidas con el método de coloración de
119 Kodama et al. y 30 con el de Howell & Black. Considerando que el ser humano tiene cinco pares
120 de cromosomas acrocéntricos asociados a NOR, se visualizaron en total 600 cromosomas
121 acrocéntricos entre ambas coloraciones. El análisis estadístico no mostró diferencias sign ificativas
122 entre ambas coloraciones respecto al número de NORs coloreados (p=0,29) (Tabla 1).
123 Tabla 1. Total de NORs (regiones organizadoras nucleolares) teñidos en los cromosomas
124 acrocéntricos por los dos métodos de comparación (Kodama et al. y Black & Howell) .
Kodama et al. Black & Howell
NORs Ag (+) %
NORs Ag (- )
%
NORs Ag (+) %
NORs Ag (- )
%
214 36 86 14 227 38 73 12
125
126
Nota: 600 cromosomas acrocéntricos equivalen al 100%
127 La Figura 1 muestra dos placas metafásicas del mismo paciente, una de ellas coloreada con
128 tinción NOR mediante el método de Howell & Black seguida de tinción GTG convencional para
129 análisis citogenético, mientras que la segunda placa solo contiene la tinción NOR. En la Figura 2
130 se observan también dos placas metafásicas, una coloreada con tinción NOR mediante el método
131 de Kodama et al. seguida de tinción GTG convencional para análisis citogenético, mientras que la
132 segunda placa solo contiene la tinción NOR. En ambos casos, se pueden visualizar las regiones
133
134
organizadoras nucleolares mediante sedimentos de color oscuro señaladas con flechas.
135 Figura 1. Cromosomas humanos teñidos por el método de Howell & Black. A: tinción NOR más
136 tinción GTG y (B) sólo tinción NOR. Las flechas muestran las regiones organizadoras nucleolares
137
138
(NOR) teñidas de plata. Aumento de 100X.
139 Figura 2. Cromosomas humanos teñidos por el método de Kodama et al. A: tinción NOR más
140 tinción GTG y (B) sólo tinción NOR. Las flechas muestran las regiones organizadoras nucleolares
141 (NOR) teñidas de plata. Aumento de 100X.
142 Los cromosomas acrocéntricos pueden ser considerados como grandes (pertenecientes al
143 grupo D según el índice de proporcionalidad centromérica) y pequeños (pertenecientes al grupo
144 G). En el grupo D se encuentran tres pares de cromosomas acrocéntricos y en el grupo G hay dos
145 pares, lo que permite calcular que en el presente trabajo se visualizaron un total de 360
146 cromosomas del grupo D y 240 del grupo G. La Tabla 3 muestra los resultados del análisis de
147 coloración NOR según los métodos de Kodama et al. y de Black & Howell para los cromosomas
148 del grupo D y la Tabla 4 muestra los resultados de coloración para los cromosomas del grupo G,
149 observándose en ambos casos que los valores positivos y negativos para ambos métodos fueron
150
151
similares (p = 0,30 a 0,59 ).
152 Tabla 2. Total de NORs (regiones organizadoras nucleolares) teñidos en los cromosomas
153 acrocéntricos del grupo D por los dos métodos de comparación (Kodama et al. y Black &Howell) .
Kodama et al. Black & Howell
NORs Ag (+)
%
NORs Ag (- )
%
NORs Ag (+)
%
NORs Ag (- )
%
130 36,1 50 13,9 135 37,5 45 12, 5
154
155
Nota: 360 cromosomas acrocéntricos equivalen al 100%.
156 Tabla 3. Total de NORs (regiones organizadoras nucleolares) teñidos en los cromosomas
157 acrocéntricos del grupo Gpor los dos métodos de comparación (Kodama et al. y Black &Howell) .
Kodama et al. Black & Howell
NORs Ag (+)
%
NORs Ag (- )
%
NORs Ag (+)
%
NORs Ag (- )
%
84 35 36 15 92 38,3 28 11, 7
158 Nota: 240 cromosomas acrocéntricos equivalen al 100%
159 La tabla 4 menciona las diferencias encontradas entre ambos métodos de coloración, mostrando
160 que, finalmente, el método de Howell & Black genera mejores resultados en el aspecto de
161
162
intensidad de tinción y calidad morfológica.
163 Tabla 4. Diferencias entre los dos métodos utilizados en el presente estudio.
Carácterísticas Kodama et al. Howell & Black
Tiempo Mayor Menor
Calidad cromosómica Menor Mayor
Intensidad
Adecuado
Adecuado y se puede osbervar más NORs teñidos
Detección de NORs
Mayores posibilidades de mala detección (manchas inespecíficas)
Menores posibilidades de mala detección (menores manchas inespecíficas)
Eficasia con el bandeo GTG
Menor
Mayor
Equipo especial No necesita No necesita
Experiencia No se requiere No se requiere
Económico Sí Sí
164
165 DISCUS IÓN
166 Es de consideración importante realizar una adecuada estandarización de técnicas de
167 tinción para el diagnóstico citogenético, mas aún cuando tienen que estar acordes con las
168 condiciones del laboratorio. Con los dos métodos empleados no se encontraron difer encias
169 estadísticamente significativas en cuanto al porcentaje de coloración positiva y negativa. N o
170 obstante, se pueden discutir ciertos aspectos importantes en un protocolo de tinción. El primero de
171 estos es la intensidad de color de los NORs. Con ambos métodos se observó una adecuada
172 intensidad de tinción, pero en el método de Kodama et al. se visualizó una mayor cantidad de
173 manchas inespecíficas alrededor y dentro de los cromosomas .
174 Factores como la temperatura, tiempo de coloración y fijadores empleados son los que
175 principalmente afectan la estabilidad e intensidad de la impregnación de plata (Derenzini & Trere,
176 1991). Se ha reportado que cuanto mayor es la temperatura, menor es el tiempo requerido para una
177 visualización selectiva de los NORs (Derenzini & Trere, 1991) y que un mayor tiempo de
178 exposición genera depósitos de plata de tamaño grande y que se expanden en todo el núcleo
179 (Derenzini et al., 1992). Ello explicaría la razón de la mayor cantidad de manchas observadas en
180 el método de Kodama et al. debido a que se emplearon tres horas de tinción. Por otra parte, en el
181 protocolo original de Kodama et al. se empleó una tela de nylon como cubreobjetos lo cual
182 favoreció una impregnación más uniforme y visible en toda la lámina, evitando así la reacción de
183 tinción intensificada en la heterocromatina centromérica que puede dificultar la identificación
184 correcta de los NORs.
185 Con respecto a la calidad morfológica de los cromosomas, se obtiene una menor distorsión
186 del cuerpo cromosómico y una adecuada tinción GTGde los cromosomas con el método de Howell
187 & Black frente al de Kodama et al.. Por tal motivo al utilizar un protector coloidal y un agente
188 reductor como el ácido fórmico en el método de Howell &Black, se evita una mayor precipitación
189 de la plata sobre el portaobjetos y se puede obtener una mejor impregnacion del bandeo GTG, lo
190 que contradice lo mencionado por Bloom & Goodpasture (1976) quienes usaron nitrato de plata
191 sin coloide y obtuvieron resultados óptimos tanto en la tinción de NOR y GTG.
192 No se puede aseverar entre este trabajo un número constante de NORs dentro de cada
193 individuo debido a que solo se estudió un número limitado de pacientes. Sin embargo, ya se tiene
194 evidencia que los patrones de tinción NORs-Ag, tanto en tamaño como distribución, son variables
195 de un individuo a otro, pero que dentro de cada persona son característicos y constantes (Varley,
196 1977; van Sluis et al., 2019).
197 Si bien en el Perú existen estudios citogenéticos realizados a madres con antecedentes de
198 abortos espontáneos recurrentes, actualmente no se cuenta con un estudio similar en parejas. Esto
199 permite generar futuras investigaciones más detalladas sobre los heteromórfismos cromosómicos
200 y demostrar si estos variaciones presentan una asociación frente a estos episodios abortivos en
201 nuestra población, lo cual reafirmaría el uso beneficioso de este tipo de tinción con un menor costo
202 de inversión.
203 Con ambos métodos se obtienen resultados similares, pero con el método Howell y Black
204 se obtiene un mejor reconocimiento de las regiones NOR con mayor integridad y tinción de los
205 cromosomas, además de requerir menor tiempo de revelación, aspecto muy importante en el área
206
207
de citogenética.
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