1 The Biologist (Lima), 2023, vol. 21 (1), XX- XX.

2

3

DOI: https:/ /doi.org/10.24039/rtb20232111533

4 Este artículo es publicado por la revista The Biologist (Lima) de la Facultad de Ciencias Naturales y Matemática, Universidad

5 Nacional Federico Villarreal, Lima, Perú. Este es un artículo de acceso abierto, distribuido bajo los términos de la licencia Creative

6 Commons Atribución 4.0 Internacional (CC BY 4.0) [https:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/deed.es] que permite el uso,

7

8

distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada de su fuente original.

9 ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL

10 COMPARISON OF TWO STAINING METHODS FOR THE DETECTION OF NUCLEOLAR

11 ORGANIZING REGIONS (NOR) OF ACROCENTRIC CHROMOSOMES

12 COMPARACIÓN DE DOS MÉTODOS DE TINCIÓN PARA LA DETECCIÓN DE

13 REGIONES ORGANIZADORAS NUCLEOLARES (NOR) DE CROMOSOMAS

14 ACROCÉNTRICOS

15 Berioska Rosas-Cartolin1* & Ismenia Gamboa-Oré 2

16 1Universidad Nacional Federico Villarreal (UNFV), Lima, Perú.

17 2Instituto Nacional Materno Perinatal (INMP), Lima, Perú.

18 *Corresponding author: berioska.biologia@gmail.com

19 Titulillo: Two staining methods for the detection of Nucleolar Organizing Regions

20 Rosas-Cartolin & Gamboa- Oré

21 Berioska Rosas-Cartolin: https://orcid.org/0000-0003-2284- 0994


22


23

Ismenia Gamboa- Oré:

https://orcid.org/0000-0002-1664- 8843

24 ABSTRACT

25 This study aimed to compare two staining methods for detecting nucleolar organizing regions

26 (NOR) of acrocentric chromosomes in the Cytogenetics Laboratory of INMP (“Instituto Nacional

27 Materno Perinatal”), Lima, Peru. Atotal of 60 metaphases with normal karyotypes were analyzed,

28 of which 30 were stained for each method: Kodama et al. and Howell & Black, respectively. The

29 recognition efficiency and staining intensity of these regions was evaluated by each technique

30 based on the count of NORs Ag (+); Likewise, the staining and integrity of the chromosomes were

31 evaluated and the differences between these two methods were established. No significant

32 differences were found regarding the number of stained regions with both techniques; however, in

33 staining intensity and chromosomal quality, the Howell & Black method was superior. It is

34 concluded that the Howell & Black method generates better results for the cytogenetic analysis of

35 these regions.

36

37

Keywords: cytogenetics – heteromorphisms – NOR - satellites

38 RESUMEN

39 El objetivo de este estudio fue comparar dos métodos de tinción para la detección de regiones

40 organizadoras nucleolares (NOR) de los cromosomas acrocéntricos en el Laboratorio de

41 Citogenética del INMP (Instituto Nacional Materno Perinatal), Lima, Perú. Se analizó un total de

42 60 metafases con cariotipos normales, de las cuales 30 fueron teñidas para cada método: Kodama

43 et al. y Howell & Black, respectivamente. Se evaluó la eficacia de reconocimiento e intensidad

44 de tinción de estas regiones por cada método en función a la contabilización de NORs Ag (+);

45 asimismo se evaluó la tinción e integridad de los cromosomas y se estableció las diferencias ent re

46 estos dos métodos. No se encontraron diferencias significativas en cuanto al número de regiones

47 teñidas con ambos métodos; sin embargo, en la intensidad de tinción y calidad cromosómica el

48 método de Howell & Black fue superior. Se concluye que el método de Howell & Black genera

49 mejores resultados para el análisis citogenético de estas regiones.

50 Palabras claves: citogenética – heteromorfismos – NOR – satélites

51

52 I NTRODUCCIÓN

53 Una parte importante del origen de problemas de fertilidad y abortos espontáneos

54 recurrentes en parejas están relacionadas con la presencia de variantes heteromórficas halladas en

55 los cromosomas observados en varias investigaciones (Madon et al., 2005; De La Fuente et al. ,

56 2009; Akbaş et al., 2012; Cheng et al., 2017; Dai et al., 2018 ).

57 Las variantes heteromórficas se relacionan a diferencias en el tamaño de segmentos

58 cromosómicos; por ejemplo, el incremento o disminución de la longitud del satélite en el brazo

59 corto o en la longitud del tallo del brazo corto en los cromosomas acrocéntricos; asimismo, se han

60 relacionado una mayor frecuencia de casos de satélites muy grandes en hombres infértiles y adultos

61 con fallas reproductivas (Madon et al., 2005; De La Fuente et al., 2009; Akbaş et al., 2012; Cheng

62 et al., 2017; Dai et al., 2018; McGowan-Jordan et al., 2020 ).

63 Estos heteromorfismos citogenéticos son detectados comúnmente con la técnica de tinción

64 estándar (bandas G); sin embargo, en muchos estudios publicados se recomienda la utilización de

65 técnicas de tinción diferenciales como bandas C, NOR, etc. (Madon et al., 2005; De la Fuente et

66 al., 2009; Radhakrishnan et al., 2010; Akbaş et al., 2012; Dong et al., 2013; Surech et al., 2016 ;

67 Zhu et al., 2019 ).

68 La técnica de tinción NOR (regiones organizadoras nucleolares) permite la detección de

69 estas variantes mediante la visualización de manchas oscuras debido a que estas regiones están

70 localizadas en los tallos y satélites de los cromosomas acrocéntricos además de que se utiliza

71 nitrato de plata, la cual tiene alta afinidad por los genes ribosómicos para la síntesis de ARN

72 ribosomal presentes en estas regiones (Hernando, 2005). Esta técnica presenta varios protocolos ,

73 pero hay dos en particular que se utilizaron para cromosomas humanos y tienen una metodología

74 manejable, las cuales son de Kodama et al. (1980) y Howell & Black (1980). La diferencia entre

75 estas dos radica en que la segunda utiliza un protector coloidal.

76 En el Perú no se han registrado estudios acerca de la implementación y aplicación de esta

77 técnica para la detección de estos satélites en pacientes, además en el Laboratorio de Citogenética

78 del INMP (“Instituto Nacional Materno Perinatal”), no se aplica esta metodología.

79 El objetivo del presente estudio fue comparar dos métodos de tinción para la detección de

80

81

NOR de cromosomas acrocéntricos en el Laboratorio de Citogenética – INMP, Lima, Perú.

82 MATERIAL Y MÉTODOS

83 El estudio se realizo en 60 células metafásicas provenientes de cultivos de linfocitos de

84 sangre periférica provenientes de pacientes derivados al Laboratorio de Citogenética del INMP

85 durante el período de setiembre y octubre del 2019 con cariotipo normal. Fueron distribuidas 30

86 para cada método de tinción. En cuando a la tinción NOR, se describe en forma resumida la

87 preparación de los diferentes métodos y sus respectivas modificaciones:

88 Método de Kodama et al. (1976)

89 Se colocaron ocho gotas de Nitrato de Plata al 50% sobre la lámina que contenía el preparado

90 cromosómico. Luego, se incubó en cámara húmeda y oscura en estufa por tres h a 60°C para

91 posteriormente lavar enérgicamente con agua destilada y dejar secar a temperatura ambiente .

92 Método de Howell & Black (1980)

93 Se colocaron gotas separadas de la solución de gelatina al 2% más ácido fórmico sobre la lámina

94 que contenía el preparado cromosómico. Luego, se añadió sobre cada gota de la solución

95 mencionada, dos gotas de Nitrato de Plata al 50% para luego homogenizar la mezcla suavemente

96 con dos cubreobjetos colocándolo sobre una placa Petri e incubando en Baño María a 60°C por

97 cinco min chequeando hasta conseguir una coloración dorado café. Se lavó la lámina con agua

98 destilada enérgicamente hasta retirar los cubreobjetos y se dejó secar a temperatura ambiente .

99 Para cada método, posteriormente, se coloreo las láminas con el protocolo de tinción GTG

100 (Giemsa-Tripsina-Giemsa) del Laboratorio de Citogenética del INMP.

101 Para evaluar la presencia de los NORs, se evaluaron las metafases al azar, leyendo la lámina

102 de cada muestra en zig-zag. Cada metafase se identificó a un aumento de 20X y posteriormente se

103 evaluó solo a los cromosomas acrocéntricos a 100X utilizando los criterios de Sotelo (1982): para

104 el conteo de los NORs se tomó en cuenta sólo la presencia o ausencia a la reacción a la plata, sin

105 importar la forma del depósito sobre la región de los organizadores nucleolares. Si la positividad

106 a la plata existió en al menos una metafase, se tomó como metafase Ag (+), contando cada

107 cromosoma acrocéntrico como unidad. El número mínimo de NORs Ag (+) por metafase sería de

108 uno, y el máximo posible de 10.

109 Se utilizó la prueba de T student en el programa estadístico R (versión 3.6.0, año 2019) ,

110 con el objetivo de realizar comparación de medias y establecer si hay diferencias significativas en

111 los resultados de los dos métodos aplicados.

112 Aspectos éticos: Esta investigación no requirió de consentimientos informados debido a que no se

113 utilizó datos personales que comprometan la confidencialidad del paciente (ejemplo: nombres,

114 dirección, teléfono, etc), asimismo no generó ningún riesgo debido a que solo se limitó a analizar

115

116

las metafases con la tinción implicada.

117 RESULTADOS

118 Se analizaron un total de 60 metafases; 30 obtenidas con el método de coloración de

119 Kodama et al. y 30 con el de Howell & Black. Considerando que el ser humano tiene cinco pares

120 de cromosomas acrocéntricos asociados a NOR, se visualizaron en total 600 cromosomas

121 acrocéntricos entre ambas coloraciones. El análisis estadístico no mostró diferencias sign ificativas

122 entre ambas coloraciones respecto al número de NORs coloreados (p=0,29) (Tabla 1).

123 Tabla 1. Total de NORs (regiones organizadoras nucleolares) teñidos en los cromosomas

124 acrocéntricos por los dos métodos de comparación (Kodama et al. y Black & Howell) .

Kodama et al. Black & Howell

NORs Ag (+) %

NORs Ag (- )

%

NORs Ag (+) %

NORs Ag (- )

%

214 36 86 14 227 38 73 12

125

126

Nota: 600 cromosomas acrocéntricos equivalen al 100%

127 La Figura 1 muestra dos placas metafásicas del mismo paciente, una de ellas coloreada con

128 tinción NOR mediante el método de Howell & Black seguida de tinción GTG convencional para

129 análisis citogenético, mientras que la segunda placa solo contiene la tinción NOR. En la Figura 2

130 se observan también dos placas metafásicas, una coloreada con tinción NOR mediante el método

131 de Kodama et al. seguida de tinción GTG convencional para análisis citogenético, mientras que la

132 segunda placa solo contiene la tinción NOR. En ambos casos, se pueden visualizar las regiones

133

134

organizadoras nucleolares mediante sedimentos de color oscuro señaladas con flechas.


135 Figura 1. Cromosomas humanos teñidos por el método de Howell & Black. A: tinción NOR más

136 tinción GTG y (B) sólo tinción NOR. Las flechas muestran las regiones organizadoras nucleolares

137

138

(NOR) teñidas de plata. Aumento de 100X.


139 Figura 2. Cromosomas humanos teñidos por el método de Kodama et al. A: tinción NOR más

140 tinción GTG y (B) sólo tinción NOR. Las flechas muestran las regiones organizadoras nucleolares

141 (NOR) teñidas de plata. Aumento de 100X.

142 Los cromosomas acrocéntricos pueden ser considerados como grandes (pertenecientes al

143 grupo D según el índice de proporcionalidad centromérica) y pequeños (pertenecientes al grupo

144 G). En el grupo D se encuentran tres pares de cromosomas acrocéntricos y en el grupo G hay dos

145 pares, lo que permite calcular que en el presente trabajo se visualizaron un total de 360

146 cromosomas del grupo D y 240 del grupo G. La Tabla 3 muestra los resultados del análisis de

147 coloración NOR según los métodos de Kodama et al. y de Black & Howell para los cromosomas

148 del grupo D y la Tabla 4 muestra los resultados de coloración para los cromosomas del grupo G,

149 observándose en ambos casos que los valores positivos y negativos para ambos métodos fueron

150

151

similares (p = 0,30 a 0,59 ).

152 Tabla 2. Total de NORs (regiones organizadoras nucleolares) teñidos en los cromosomas

153 acrocéntricos del grupo D por los dos métodos de comparación (Kodama et al. y Black &Howell) .

Kodama et al. Black & Howell

NORs Ag (+)

%

NORs Ag (- )

%

NORs Ag (+)

%

NORs Ag (- )

%

130 36,1 50 13,9 135 37,5 45 12, 5

154

155

Nota: 360 cromosomas acrocéntricos equivalen al 100%.

156 Tabla 3. Total de NORs (regiones organizadoras nucleolares) teñidos en los cromosomas

157 acrocéntricos del grupo Gpor los dos métodos de comparación (Kodama et al. y Black &Howell) .

Kodama et al. Black & Howell

NORs Ag (+)

%

NORs Ag (- )

%

NORs Ag (+)

%

NORs Ag (- )

%

84 35 36 15 92 38,3 28 11, 7

158 Nota: 240 cromosomas acrocéntricos equivalen al 100%

159 La tabla 4 menciona las diferencias encontradas entre ambos métodos de coloración, mostrando

160 que, finalmente, el método de Howell & Black genera mejores resultados en el aspecto de

161

162

intensidad de tinción y calidad morfológica.

163 Tabla 4. Diferencias entre los dos métodos utilizados en el presente estudio.

Carácterísticas Kodama et al. Howell & Black

Tiempo Mayor Menor

Calidad cromosómica Menor Mayor

Intensidad

Adecuado

Adecuado y se puede osbervar más NORs teñidos

Detección de NORs

Mayores posibilidades de mala detección (manchas inespecíficas)

Menores posibilidades de mala detección (menores manchas inespecíficas)

Eficasia con el bandeo GTG

Menor

Mayor

Equipo especial No necesita No necesita

Experiencia No se requiere No se requiere

Económico Sí Sí

164

165 DISCUS IÓN

166 Es de consideración importante realizar una adecuada estandarización de técnicas de

167 tinción para el diagnóstico citogenético, mas aún cuando tienen que estar acordes con las

168 condiciones del laboratorio. Con los dos métodos empleados no se encontraron difer encias

169 estadísticamente significativas en cuanto al porcentaje de coloración positiva y negativa. N o

170 obstante, se pueden discutir ciertos aspectos importantes en un protocolo de tinción. El primero de

171 estos es la intensidad de color de los NORs. Con ambos métodos se observó una adecuada

172 intensidad de tinción, pero en el método de Kodama et al. se visualizó una mayor cantidad de

173 manchas inespecíficas alrededor y dentro de los cromosomas .

174 Factores como la temperatura, tiempo de coloración y fijadores empleados son los que

175 principalmente afectan la estabilidad e intensidad de la impregnación de plata (Derenzini & Trere,

176 1991). Se ha reportado que cuanto mayor es la temperatura, menor es el tiempo requerido para una

177 visualización selectiva de los NORs (Derenzini & Trere, 1991) y que un mayor tiempo de

178 exposición genera depósitos de plata de tamaño grande y que se expanden en todo el núcleo

179 (Derenzini et al., 1992). Ello explicaría la razón de la mayor cantidad de manchas observadas en

180 el método de Kodama et al. debido a que se emplearon tres horas de tinción. Por otra parte, en el

181 protocolo original de Kodama et al. se empleó una tela de nylon como cubreobjetos lo cual

182 favoreció una impregnación más uniforme y visible en toda la lámina, evitando así la reacción de

183 tinción intensificada en la heterocromatina centromérica que puede dificultar la identificación

184 correcta de los NORs.

185 Con respecto a la calidad morfológica de los cromosomas, se obtiene una menor distorsión

186 del cuerpo cromosómico y una adecuada tinción GTGde los cromosomas con el método de Howell

187 & Black frente al de Kodama et al.. Por tal motivo al utilizar un protector coloidal y un agente

188 reductor como el ácido fórmico en el método de Howell &Black, se evita una mayor precipitación

189 de la plata sobre el portaobjetos y se puede obtener una mejor impregnacion del bandeo GTG, lo

190 que contradice lo mencionado por Bloom & Goodpasture (1976) quienes usaron nitrato de plata

191 sin coloide y obtuvieron resultados óptimos tanto en la tinción de NOR y GTG.

192 No se puede aseverar entre este trabajo un número constante de NORs dentro de cada

193 individuo debido a que solo se estudió un número limitado de pacientes. Sin embargo, ya se tiene

194 evidencia que los patrones de tinción NORs-Ag, tanto en tamaño como distribución, son variables

195 de un individuo a otro, pero que dentro de cada persona son característicos y constantes (Varley,

196 1977; van Sluis et al., 2019).

197 Si bien en el Perú existen estudios citogenéticos realizados a madres con antecedentes de

198 abortos espontáneos recurrentes, actualmente no se cuenta con un estudio similar en parejas. Esto

199 permite generar futuras investigaciones más detalladas sobre los heteromórfismos cromosómicos

200 y demostrar si estos variaciones presentan una asociación frente a estos episodios abortivos en

201 nuestra población, lo cual reafirmaría el uso beneficioso de este tipo de tinción con un menor costo

202 de inversión.

203 Con ambos métodos se obtienen resultados similares, pero con el método Howell y Black

204 se obtiene un mejor reconocimiento de las regiones NOR con mayor integridad y tinción de los

205 cromosomas, además de requerir menor tiempo de revelación, aspecto muy importante en el área

206

207

de citogenética.

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260 Received December 13, 2022.

261

262

263

264

Accepted January 25, 2023.