The Biologist
(Lima)
The Biologist (Lima), 2021, vol. 19 (1), 57-64.
ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL
1Laboratorio de Tecnología de Alimentos. Facultad de Oceanografía, Pesquería, Ciencias Alimentarias y Acuicultura.
Universidad Nacional Federico Villarreal (UNFV). Lima. Perú.
2Escuela Profesional de Ingeniería de Alimentos. Facultad de Ingeniería Pesquera y de Alimentos Universidad Nacional del
Callao (UNAC). Callao. Perú.
3Laboratorio de Parasitología. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Ricardo Palma (URP). Lima. Perú.
4Laboratorio de Ecología y Biodiversidad Animal. Facultad de Ciencias Naturales y Matemática. Grupo de Investigación en
Sostenibilidad Ambiental (GISA), Escuela Universitaria de Posgrado, Universidad Nacional Federico Villarreal (EUPG
–UNFV). Lima. Perú.
5Unidad de Investigación, Innovación y Emprendimiento. Facultad de Ciencias Sociales.
Universidad Nacional Federico Villarreal (UNFV). Lima. Perú.
6Facultad de Industrias Alimentarias. Universidad Nacional Agraria de la Selva (UNAS). Huánuco. Perú.
7Laboratorio de Geografía y Medio Ambiente. Facultad de Ingeniería Geográfica, Ambiental y Ecoturismo. Universidad
Nacional Federico Villarreal (UNFV). Lima, Perú.
8Facultad de Industrias Alimentarias. Universidad Nacional Agraria de la Selva (UNAS), Huánuco, Perú.
*Corresponding author: omarin@unfv.edu.pe
1,2, * 3,4 5 6
Olegario Marín-Machuca ; José Iannacone ; Raúl Ernesto Porras-Lavalle ; Fredy Aníbal Alvarado-Zambrano ;
7 8
Ahuber Omar Vásquez-Aranda & Ricardo Arnaldo Alvarado-Zambrano
ABSTRACT
Keywords: Aspergillus niger – orange peel – fermentation – inorganic and organic nitrogen
The use of citrus by-products was evaluated through the fermentation of the orange peel by means of
Aspergillus niger van Tieghem strain, 1867, which was obtained by inoculation in a petri dish, at a
temperature of 35°C and a pH of 4,3. The crushed orange peel was used as a substrate, partially
dehydrated, spread on trays, dried in cardboard trays and without heat pretreatment, adding only
components and mineral nutrients, and A. niger was cultivated at different fermentation temperatures
between 8°C and 40 °C. Upon completion of the fermentation process of the pretreated orange peel,
maximum percentages of transformation of mineral nitrogen to organic nitrogen of 34.5% were obtained,
for a value of the thermal integral between 0°C and 320°C per day, obtaining 1 kg of dry matter, 6.6%
protein for 600 g of product (feed) with 18% protein. Finally, the variation of the pH of the substrate was
correlated as a function of the thermal integral of the feedstock; the performance of the transformation of
mineral to organic nitrogen as a function of the thermal integral of the feedstock and the evolution of the
organic nitrogen content of the orange peel fermented by A. niger compared to the thermal integral. The
results show high correlation coefficients. It is concluded that it is possible to take advantage of citrus by-
products by fermentation of the orange peel by A. niger.
The Biologist (Lima)
ISSN Versión Impresa 1816-0719
ISSN Versión en linea 1994-9073 ISSN Versión CD ROM 1994-9081
doi:10.24039/rtb2021191882
57
USE OF CITRUS BY-PRODUCTS: FERMENTATION OF THE ORANGE PEEL BY
ASPERGILLUS NIGER VAN TIEGHEM, 1867
APROVECHAMIENTO DE SUBPRODUCTOS CÍTRICOS: FERMENTACIÓN DE LA
CORTEZA DE NARANJA POR ASPERGILLUS NIGER VAN TIEGHEM, 1867
https://orcid.org/0000-0001-7615-0986
D
The Biologist (Lima). Vol. 19, Nº1, jan - jun 2021
RESUMEN
Palabras clave: Aspergillus niger – corteza de naranja – fermentación – nitrógeno inorgánico y orgánico
Se evaluó el aprovechamiento de los subproductos cítricos mediante la fermentación de la corteza de
naranja por medio de Aspergillus niger van Tieghem, 1867, el que fue obtenido por inoculación en placa
Petri, a temperatura de 35°C y a un pH de 4,3. Se utilizó como substrato la corteza de naranja triturada,
parcialmente deshidratada, extendida en bandejas, secada en bandejas de cartón y sin pretratamiento
térmico, añadiéndole, únicamente, componentes y nutrientes minerales, y se cultivó a A. niger a diferentes
temperaturas de fermentación entre 8°C y 40°C. Al culminar el proceso fermentativo de la corteza de
naranja pretratada se obtuvieron porcentajes máximos de transformación de nitrógeno mineral a
nitrógeno orgánico de 34,5 %, para un valor de la integral térmica entre 0°C y 320°C por día, obteniendo
para un kg de materia seca, 6,6 % de proteína para 600 g de producto (pienso) con 18 % de proteína.
Finalmente, se correlacionó la variación del pH del sustrato en función de la integral térmica del cultivo; el
rendimiento de la transformación del nitrógeno mineral a orgánico en función de la integral térmica del
cultivo y la evolución del contenido de nitrógeno orgánico del sustrato de naranja fermentado por el A.
niger frente a la integral térmica. Los resultados muestran altos coeficientes de correlación. Se concluye
que es posible aprovechar los subproductos cítricos mediante la fermentación de la corteza de naranja por
A. niger.
INTRODUCCIÓN
58
La producción de alimentos proteicos no
tradicionales a partir de residuos y subproductos
agrícolas, tanto para la alimentación humana como
para animales, como el ganado, han experimentado
un incremento progresivo en los últimos años. Se
han empleado los residuos de la caña de azúcar y
luego la azúcar refinada como materia prima para
la obtención de ácido cítrico en residuos de frutas
cítricas, generando un alto costo de producción,
donde con el transcurrir de los años se han buscado
nuevas alternativas de producción más
económicas; logrando cultivar a Aspergillus niger
van Tieghem strain, 1867 con azúcar morena,
obteniéndose buenos resultados, pero con un costo
aún alto (Sáez et al., 2002; Roukas & Kotzekidou,
2020).
Es importante conocer las características de A.
niger para su identificación, las cuales son: cabezas
conidiales de tonos negro a negro grisáceo, negro
café, negro púrpura y negro carbón. La
caracterización morfológica de la cepa de A. niger
AL01 confirma que la cepa empleada se trata de un
A. niger var. niger, y muestra las características
principales detalladas para la identificación y
aplicación de las cepas de dicho hongo en la
fermentación de la corteza de residuos cítricos
(Sáez et al., 2002; Ahmed et al., 2016).
Uno de los métodos más prometedores para la
producción de proteína no convencional lo
constituye la Fermentación en Fase Sólida (FFS)
de los residuos lignocelulósicos (Santos et al.,
2020), lo cual está determinado en primera
instancia, a los grandes volúmenes de estos
residuos que se producen anualmente en el mundo,
y, en segundo lugar, por las ventajas que tiene el
sistema de FFS sobre las fermentaciones
sumergidas convencionales; complementando que
la caña de azúcar como sus residuos
agroindustriales se utilizan en la producción de
alimento animal enriquecido en proteína por FFS
(Julián & Ramos, 2007).
El crecimiento en estado sólido, normalmente
sobre una placa de agar en una caja Petri, permite
medir la cantidad de biomasa producida para
diversas concentraciones iniciales de glucosa, pero
no es fácil la determinación de los productos
excretados, como en un medio líquido, por lo que
solo se obtiene un conocimiento limitado acerca
del metabolismo de A. niger. Los estudios
realizados en sustratos sólidos, como es el caso de
Marín et al.
59
la cáscara de naranja parcialmente deshidratada, no
han incorporado ninguna información basada en el
conocimiento de las rutas metabólicas de este
microorganismo, lo que nos permitiría describir el
crecimiento de A. niger de una forma menos
empírica (Reyes-Ocampo et al., 2013; Abdullah et
al., 2020; Sepúlveda et al., 2020).
Es necesario plantear alternativas de alimentación
animal basada en fuentes y alimentos no
convencionales y es aquí, donde opciones
biotecnológicas como las fermentaciones y en
especial la fermentación en estado sólido (FES) se
consolidan como una alternativa para la generación
de alimentos proteico-energéticos de buena calidad
y de bajo costo, evaluando el pH y el contenido de
nitrógeno orgánico, situación que mejorará la
rentabilidad del agronegocio ganadero y en general
de las producciones pecuarias, dando una
alte rnati va eco nómic am ente v iable y
ambientalmente sostenible (Borrás-Sandoval &
Torres-Vidales, 2016).
En la actualidad los altos índices de contaminación
han llevado a los gobiernos de todo el mundo a
exigir a las industrias de productos cítricos una
producción limpia, lo cual hace que las empresas
planteen soluciones para disminuir sus cargas
contaminantes, en virtud que la industria
alimenticia genera una gran cantidad de residuos
orgánicos e inorgánicos, de características
contaminantes y la biotecnología y la fermentación
son una excelente alternativa en la biodegradación
de estos desechos, convirtiéndolos en materias
primas para la obtención de importantes productos
de consumo. En la producción de piensos con A.
niger los niveles de los nutrientes y las condiciones
ambientales, como pH, agitación, temperatura,
iones metálicos, concentración de fosfato, fuente
de nitrógeno y carbono, alcoholes y aditivos, son
factores importantes que regulan la morfología del
microorganismo y el proceso fermentativo (López
et al., 2005).
Los modelos cinéticos para la producción de
celulasas son escasos, especialmente para procesos
de fermentación en fase sólida, en la que sólo se ha
hallado trabajos relacionados que presentan un
modelo cinético simple para describir la dinámica
de la actividad de varias enzimas en un crecimiento
modélico del hongo A. niger en placas Petri, en
cuyo modelo no se establecen relaciones
matemáticas con varias variables del proceso, todo
lo cual limita su aplicación y, que el modelo
cinético (polinomial) propuesto por los autores de
este trabajo está estructurado de forma que se tiene
en cuenta la desnaturalización de la enzima por la
hidrolisis de la celulasa por las proteasas, y la
inhibición de las enzimas debido al máximo
crecimiento del microorganismo, en la que ocupa
todo su espacio vital y deja de crecer (León-Revelo
et al., 2018).
El plátano Dominico Harton en estado maduro es
un fruto abundante en carbohidratos, por lo que se
empleó como sustrato en un proceso de
fermentación al agente A. niger (Velásquez et al.,
2010). La cáscara de naranja puede convertirse en
un material esencial para la elaboración de
biopelículas debido a su contenido en fibras de
celulosa, pectina y aceites esenciales; donde la
composición de la cáscara de naranja varía de
acuerdo con la especie y a las condiciones de su
cultivo, reportándose que la naranja contiene 14,27
% másico de cáscara; a su vez, la cáscara seca
contiene 53,27 % másico de carbohidratos; y que a
su vez, los residuos de naranja contienen los
porcentajes másicos siguientes: pectina, 29,8;
celulosa, 18,7; y, hemicelulosa, 20,9; vale decir que
el contenido de celulosa es cercano al 20% (Alata et
al., 2019).
Las enzimas pépticas se utilizan en la industria de
alimentos, debido a que la degradación de la
pectina disminuye la viscosidad de los jugos,
facilitando así procesos como clarificación,
filtración y concentración de los extractos de frutas
y vegetales. Numerosas compañías producen
comercialmente enzimas pépticas a partir de
hongos, en especial del género Aspergillus,
mediante fermentación en sustrato sumergido o en
sustrato sólido (Lozano & López, 2018; Ozdal &
Kurbanoglu, 2019).
El propósito del presente trabajo fue utilizar y
aprovechar los residuos y subproductos de la
industria citrícola (corteza de naranja) por acción
de A. niger para obtener piensos proteinizados para
animales y evaluar el pH en función de la integral
térmica (°C x día), el rendimiento de nitrógeno en
función de la integral térmica (°C x día) y la
cuantificación del nitrógeno orgánico (% base
seca) en función de la integral térmica.
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Fermentation of the orange bark by Aspergillus
60
Sustrato
Se utilizó el residuo de corteza de naranja
procedente de los mercados aledaños (Santa Rosa,
Vencedores y Corazón de Jesús), Lima, Perú, y de
los vertederos de algunas plantas procesadoras de
frutas cítricas. Se realizaron algunos procesos de
tratamiento de residuos sólidos, entre ellos el de un
secado convenientemente. El subproducto
obtenido se trituró y pasó a un proceso de molienda
mecánico. Al subproducto proveniente de la
molienda, por cada kg de materia seca de substrato
se le adicionó como nutriente 60 g de nitrato
amónico, 4 g de fosfato potásico y 4 g sulfato de
magnesio; que, según técnica diseñada, no se
aplica tratamiento térmico previo alguno. Las
condiciones de proceso fueron mantenidas
constantes o con mínima variación del pH (4,3) y
de la temperatura (32 °C).
Integral térmica
La integral térmica, en °C x día se define como la
temperatura acumulada e integrada, que es
necesaria para completar un estado fenológico
(plantas), un estadio larvario (artrópodos) o el
ciclo completo de un ser vivo como es el caso del A.
niger. Este concepto es utilizado en biología,
procesos fermentativos, procesos biológicos y para
realizar modelos matemáticos de predicción de
desarrollo microbiano. Así mismo, la integral
térmica corresponde a un índice de disponibilidad
de calor para el desarrollo y maduración de
especies vegetales (corteza de naranja,
previamente deshidratada). Si desde el momento
que se produce la germinación de un cultivo se
suman las temperaturas medias de cada día hasta el
momento de madurez, la suma total es siempre la
misma.
Condiciones y aspectos del proceso
El proceso fue llevado a cabo en condiciones de no
esterilidad en todas las etapas de la investigación,
dado que las cepas del A. niger no permiten el
desarrollo y proliferación de microorganismos.
Aún en estas condiciones se realizaron los
controles microbianos respectivos, durante las 24 h
y en toda la investigación. Así mismo, se evaluó el
pH por medio de medición elemental simple
usando pH metro, la cuantificación del nitrógeno
por el método micro Kjeldahl y la variación de
MATERIALES Y MÉTODOS materia seca por método de constancia de masa
(Romero-Fernández et al., 2019).
Relación de las variables dependientes y la
independiente
La variación del pH en función de la integral
térmica (°C x día), el rendimiento (en %) de
nitrógeno inorgánico transformado a nitrógeno
orgánico en función de la integral térmica (°C x
día) y el nitrógeno orgánico (% base seca) en
función de la integral térmica (°C x día).
El inóculo
Con respecto al inóculo, se empleó una cepa de A.
niger, procedente del laboratorio de microbiología
de la “Farmacia Universal” de Lima, Perú. Las
características principales de las cepas de A. niger,
para su identificación fueron: cabezas conidiales
de tonos oscuros a negro grisáceo, de formas
radiadas o divididas formando columnas de
cadenas de conidios irregulares o bien definidos.
La cepa se mantuvo en extracto de malta al 2%. Se
preparó una suspensión de esporas por extracción
con una solución de sulfato sódico al 0,01% en
agua estéril (tratada a 100°C por 10 min) sobre
placas del cultivo esporulado, presentando una
8 3
concentración de 4,5 x 10 esporas por cm ,
sirviendo para inocular el substrato de corteza de
naranja a razón de 20 mL de substrato por cada kg
de materia seca. Se realizó la determinación de
aflatoxinas, por inoculación en placa Petri durante
24 h y durante el periodo de la fase fermentativa.
Cultivo
El substrato inoculado para el cultivo fue extendido
3
en bandejas de plástico de 25 x 40 x 10 cm , con una
densidad de carga de 25 kg de corteza de naranja
2
fresca por m de bandeja, las cuales se cultivaron a
8°C, 18°C, 26°C y 37°C, respectivamente. En
cuanto a los métodos analíticos, la materia seca se
determinó por desecación en estufa (equipo que
está provisto de una capacidad de 5 kg y
temperatura de hasta 130 °C) a 104°C, hasta peso
constante; el pH, nitrógeno total, y el nitrógeno
mineral.
Materia seca
El contenido en materia seca (MS) o contenido en
extracto seco, es la proporción porcentual de
sólidos en una mezcla sólida (cáscara de naranja
parcialmente deshidratada) y, cuanto más alta sea
esta proporción, más seca será esta mezcla sólida.
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Marín et al.
La unidad del contenido MS es [% p/p] y el
procedimiento para determinar el contenido MS
fue medida en el laboratorio donde para ello se
extrajo una muestra de cáscara de naranja
parcialmente deshidratada (que en algunas
ocasiones es llamada materia fresca) que fue
calentada en la mufla por encima de 100 °C para
que la humedad residual (en su mayoría, agua) se
evapore. El residuo seco restante se pesó y
ponderó; ello dio como resultado el contenido de
sustancia seca de la mezcla de corteza de naranja
parcialmente deshidratada.
Análisis de datos
Los datos obtenidos se trataron estadísticamente
realizando un análisis de regresión cuadrática,
validado por su coeficiente de regresión de Person.
Para el coeficiente de correlación r de Pearson se
utilizó la fórmula siguiente:
Donde yrepresenta los valores calculados por el
c
modelo de estimación, y representa la media
elemental de los datos experimentales y y
representa a los datos experimentales.
Aspectos éticos: Los autores señalan que se
cumplieron todos los aspectos éticos a nivel
nacional e internacional.
61
RESULTADOS
Los cultivos, como se reseña en la parte
experimental, se realizaron sin tratamiento térmico
previo buscando con ello que el aporte energético y
proteico al proceso fuera el menor posible. A pesar
de las condiciones no estériles, no se detectó
desarrollo de microorganismos diferentes a A.
niger, ni la presencia de aflatoxinas (análisis
realizado por inoculación en placa Petri durante 24
h y durante el periodo de la fase fermentativa) en
los diferentes controles realizados a los cultivos.
Periódicamente se evaluó el pH del substrato, el
contenido de nitrógeno y la variación de materia
seca de los cultivos, como el índice de
metabolización de la materia orgánica, y se analizó
su relación con los factores de tiempo, temperatura
e integral térmica.
La fermentación de cortezas de naranja y de
cualquier subproducto cítrico, mediante cepas del
A. niger, manteniendo condiciones de proceso
estables, es una excelente alternativa en la
biodegradación de estos desechos, convirtiéndolos
en materias primas para la obtención de
importantes productos de consumo animal, como
son los piensos para animales mayores,
especialmente vacunos.
Los valores del pH, el rendimiento (nitrógeno
transformado/nitrógeno transformable) y el
nitrógeno orgánico (% base seca) en función de la
integral térmica (ºC x día) se presentan en las tablas
1, 2 y 3; respectivamente.
Tabla1. Valores del pH vs la integral térmica (ºC x día).
Integral térmica (°C × día) pH
50 3,7
80
3,4
100
3,5
130
3,5
150
3,4
200
3,2
250
3,5
300 3,7
350 4,3
400 5,0
450 6,1
500 6,2
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Fermentation of the orange bark by Aspergillus
62
Correlacionando los datos de la tabla 1, se llega a
determinar la relación de orden cuadrática con su
coeficiente de correlación correspondiente. La
relación de orden cuadrática, que hace la
estimación respectiva de la dependencia del pH en
función la integral térmica es el modelo expresado
por la ecuación (1)
con un coeficiente de correlación de Person igual a:
Correlacionando los datos de la tabla 2, se llega a
determinar la relación de orden cuadrática con su
coeficiente de correlación correspondiente. La
relación de orden cuadrática, que hace la
estimación respectiva de la dependencia del
rendimiento en función la integral
térmica es el modelo expresado por la ecuación (2)
con un coeficiente de correlación Person igual a
Tabla 2. Valores del rendimiento vs integral térmica (ºC x día).
Tabla 3. Valores del nitrógeno orgánico vs la integral térmica (ºC x día).
Integral térmica
(°C × día)
Nitrógeno orgánico
(% base seca)
50 1,7
100 2,6
150 3,0
200 3,5
250 3,5
300 3,6
350 3,7
400 3,7
450 3,5
500 3,5
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Marín et al.
El proceso de fermentación de la corteza de naranja
por acción del A. niger, los cuales se realizaron sin
tratamiento térmico previo, condujeron a un aporte
energético y proteico considerable. Es fácil medir
la cantidad de biomasa producida para diversas
concentraciones iniciales de glucosa, en la cual no
se detectó desarrollo de microorganismos
diferentes a pesar de las condiciones no estériles y
sin presencia de aflatoxinas (Reyes-Ocampo et al.,
2013; Khalil et al., 2020).
Al evaluar el pH del substrato y el contenido de
nitrógeno como el índice de metabolización de la
materia orgánica, se ha determinado que existe
mejorías sustanciales en la calidad y rentabilidad
del pienso producido y en general de las
producciones pecuarias, dando una alternativa
económicamente viable y de un desarrollo
sostenible por un periodo largo de tiempo (Borrás-
Sandoval & Torres-Vidales, 2016).
La corteza de naranja fermentada mediante cepas
del A. niger previamente triturada y deshidratada y
cualquier subproducto cítrico, es una excelente
alternativa en la biodegradación de estos desechos,
convirtiéndolos en materias primas para la
obtención de importantes productos como son los
piensos para animales mayores (López et al., 2005;
Anand et al., 2017; Vidya et al., 2018).
El pH representado en función de la integral
térmica va a presentar un comportamiento
63
Correlacionando los datos de la tabla 3, se llega a
determinar la relación de orden cuadrática con su
coeficiente de correlación correspondiente. La
relación de orden cuadrática, que hace la
estimación respectiva de la dependencia del
nitrógeno orgánico (% base seca) en función la
integral térmica es el modelo expresado por la
ecuación (3)
con un coeficiente de correlación de Person igual a
DISCUSIÓN
logístico, llegando a describir expresiones que
estiman fenómenos para valores de pH
referenciales adecuados óptimos (León-Revelo et
al., 2018). La dispersión estadística de la relación
entre nitrógeno transformado y el nitrógeno
transformable frente a la integral térmica será un
fenómeno de transferencia de tipo no lineal; la
misma que fue validada estadísticamente. Al
correlacionar el pH con la integral térmica tiene un
comportamiento cóncavo hacia arriba similar una
expresión analítica logística, siendo necesario
desarrollar expresiones de que describan
fenómenos para valores de pH óptimos
referenciales adecuados. En este estudio se llegó a
determinar expresiones polinómicas de segundo
grado, que no son modelos ni expresiones
logísticas y llegando a tener diferencia a lo
reportado por otros autores (León-Revelo et al.,
2018).
Las cantidades numéricas de pH, rendimiento
(nitrógeno transformado/nitrógeno transformable)
y de nitrógeno orgánico (% base seca) en función
de la integral térmica (ºC x día) se correlacionaron
adecuadamente, concluyendo que dichos valores
se pueden representar por modelos algebraicos
elementales y, por ser modelos, únicamente
bivariables, tienen un valor del coeficiente de
correlación r Pearson igual o mayor a 0,96.
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