The Biologist
(Lima)
ISSN Versión Impresa 1816-0719
ISSN Versión en linea 1994-9073 ISSN Versión CD ROM 1994-9081
ORIGINAL ARTICLE /ARTÍCULO ORIGINAL
SPORES AND BIOMASS OF BEAUVERIA BASSIANA IN LIQUID MEDIA
SUPPLEMENTED WITH EURYSACCA MELANOCAMPTA AND PERONOSPORA
FARINOSA
OBTENCIÓN DE ESPORAS Y BIOMASA DE BEAUVERIA BASSIANA EN MEDIOS
LÍQUIDOS SUPLEMENTADOS CON EURYSACCA MELANOCAMPTA Y PERONOSPORA
FARINOSA
Pedro Laynes; Rosalyn Acuña & Ana Gutiérrez
Universidad Nacional Federico Villarreal. Facultad de Ciencias Naturales y Matemática (FCCNM).Laboratorio de
Bioquímica y Biología Molecular. Jr. Río Chepen s/n. El Agustino. Lima – Perú
anaisabelflor@gmail.com
The Biologist (Lima), 14(1), jan-jun: 75-87.
75
ABSTRACT
Keywords: Beauveria bassiana – Eurysacca melanocampta – quitin colloidal – laminarin
The aim of this investigation was to study the growth of Beauveria bassiana, grown in liquid
media supplemented with minimum media with more artificial substrate (glucose, laminarin o
colloidal chitin) and with minimum media with more natural substrate from E. melanocampta or
Peronospora farinosa, for which we evaluated the number of spores and biomass. For this was
used the CCB-LE 262 strain of B. bassiana, which was inoculated in different culture media and
for which growth was evaluated after 24 h, 96 h and 216 h. Our results indicate that the highest
number of spores was obtained in the artificial culture medium supplemented with laminarin
6 -1
(ML), with spores 67.80 x 10 ·mL , whereas the best natural media was that supplemented with
6 -1
powder of E. melanocampta (M ), with 18.53 x 10 mL spores. The highest biomass was
Em -1
obtained at 96 h in the artificial medium of colloidal chitin (MM+QC), with 5.085 mg·mL ;
-1
biomass at 216 hours for the natural medium M , was 8.59 mg·mL . We conclude that the in vitro
Em
culture of B. bassiana, supplemented with laminarin, colloidal chitin and E melanocampta
substrates, induce spore formation and high biomass.
Los hongos entomopatógenos Hyphomycetes
son componentes importantes y están
presentes en la mayoría de los ecosistemas
terrestres (Mishra et al. 2013, Husnain et al.
2014). Pueden ser usados como elementos
importantes del manejo integrado de plagas
(MIP) (Prasad & Pal 2014, Khan et al. 2013) y
así enfrentar el aumento de la resistencia a
insecticidas y mitigar las consecuencias
ambientales por el uso de plaguicidas (Pham et
al. 2009, Senthamizhlselvan et al. 2010,
Nahayo & Bayisenge 2012, Husnain et al.
2014). Una ventaja clave de estos agentes de
control microbiano es su fácil producción en
masa y almacenamiento, manteniéndose
eficaces en un amplio rango de temperaturas y
niveles de humedad, además de persistir en el
medio ambiente, ofreciendo supresión
continua de las poblaciones de plagas de
insectos (Subramanian & Punamalai 2013,
Prasad & Pal 2014).
B e a u v e r i a b a s s i a n a ( Asc omy cot a:
Hypocreales), pertenece a esta clase de hongos
y crece formando conidios y/o esporas; cuyo
mecanismo de acción se da cuando las esporas
entra en contacto con el cuerpo de un insecto
huésped, germinan y penetran en la cutícula
La polilla de la quinua, Eurysacca
melanocampta, Meyrick, 1917 (Lepidoptera:
Gelechiidae), también llamada “kcona kcona”,
es la plaga más importante del cultivo de
quinua y se caracteriza porque en su estado
larval destruye los granos de quinua maduros y
en formación, observándose que cuando las
infestaciones son altas (hasta 250
larvas/planta), llegan a destruir por completo la
producción del cultivo (Aroni et al. 2009,
Costa et al. 2009).
Por otra parte el Oomicete Peronospora
farinosa f. sp. chenopodii FR. 1849 (llamada
también Peronospora variabilis Gäum o
Peronospora variabilis f. sp. Chenopodii
Byford) ocasiona la enfermedad del “mildiu”
en la quinua, afectando al follaje de la planta
durante su crecimiento, formando áreas
cloróticas grandes e irregulares que
inicialmente se observan como clorosis en la
cara superior y finalmente produciendo
necrosis, lo cual tiene un efecto sobre su
desarrollo y crecimiento (Danielsen & Ames
2010).
INTRODUCCIÓN
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El objetivo de esta investigación fue estudiar el crecimiento de Beauveria bassiana, cultivado en
medios líquidos suplementados con medio mínimo más sustratos artificiales (glucosa,
laminarina o quitina coloidal) y con medio mínimo más sustratos naturales provenientes de
Eurysacca melanocampta o Peronospora farinosa, para lo cual se evaluó el número de esporas y
la cantidad de biomasa. Para ello se utilizó la cepa de B. bassiana CCB-LE 262, la cual fue
inoculada en diferentes medios líquidos y donde se evaluó su crecimiento durante las 24 h, 96 h y
216 h. Nuestros resultados indican que a las 216 h la mayor cantidad de esporas se obtuvo en el
6 -1
medio artificial suplementado con laminarina (ML), con 67,80 esporas x 10 ·mL , mientras que
el mejor medio natural fue el suplementado con polvo de E. melanocampta (M ) con 18,53
Em
6 -1
esporas x 10 mL . La mejor biomasa se encontró a las 96 h, en el medio artificial de quitina
-1 -1
coloidal (MQ) con 5.085 mg·mL y a las 216 h para el medio natural M , fue de 8,59 mg·mL . Se
Em
concluye que el cultivo in vitro de B. bassiana, suplementados con sustratos de laminarina,
quitina coloidal y E. melanocampta inducen la formación de esporas y de biomasa.
RESUMEN
Palabras clave: Beauveria bassiana – Eurysacca melanocampta – quitina coloidal – laminarina
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Laynes et al.
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creciendo dentro del insecto y matándolo en
cuestión de días. De allí que sea considerado
un hongo eficiente como agente de control
biológico, que además, no requiere ser
ingerido (Pedrini et al. 2007, Dhar & Kaur
2010, Mishra et al. 2013).
Las formas miceliales de B. bassiana se
caracterizan por llevar esporas asexuales
llamadas conidios que sirven como propágulos
infectivos y son dispersadas por el viento
(Mustafa & Kaur 2009, Subramanian &
Punamalai 2013). En sustratos sólidos, estos
hongos producen abundantes conidios aéreas
que son susceptibles de almacenamiento como
preparaciones secas; a diferencia de esto, en
cultivo sumergido crecen con alta producción
y concentraciones de propágulos vegetativos
levaduriformes y otros llamados blastosporas
que son típicamente más grandes que las
conidios aéreas (Vega et al. 2003, Lohse et al.
2014). Thomas et al. (1987) y Jenkins et al.
(1993), mencionan que las células hifales,
también llamadas cuerpos hifales o
blastosporas, suelen ser el único tipo de
propágulos producidos en los esquemas de
fermentación líquidos. Sin embargo, la
patogenicidad de las blastosporas y esporas
aéreas es la misma (Subramanian & Punamalai
2013).
El objetivo de este trabajo fue obtener esporas
y biomasa en medios líquidos suplementados
con E. melanocampta y P. farinosa; para lo
cual se evaluó el número de esporas y cantidad
-1
de biomasa expresada en mg·mL .
Cepa del hongo
La cepa de B. bassiana fue obtenida del
Servicio Nacional de Sanidad Agraria
(SENASA) con código CCB-LE 262,
cultivada y almacenada en arroz. Se hicieron
diluciones hasta obtener un cultivo
monospórico con el medio solido agar-papa-
glucosa (APG), de donde fue seleccionada una
sola cepa, y cultivada por cuatro días, en el
medio líquido enriquecido glucosa-peptona-
extracto de levadura (GPE). La nueva cepa fue
denominada BbQcR1, y con ella se realizaron
todos los experimentos posteriores.
Medio de enriquecimiento líquido
Este medio, se formuló con la finalidad de
obtener una cepa con crecimiento uniforme y
en óptimas condiciones nutricionales para
poder ser utilizada en los distintos medios a
evaluar. Para ello se preparó 100 ml del medio
GPE: (Glucosa 4% p/v, Peptona 1% p/v y
Extracto de levadura 1% p/v) a pH a 5,6. Al
medio se le añadió el inóculo de B. bassiana y
fue mantenido a temperatura ambiente (26 ±
2°C), en un agitador orbital (Orbital Genie
2013) a 130 rpm por cuatro días.
Posteriormente el contenido fue centrifugado
3000 rpm y lavado con suero fisiológico para
recuperar las esporas.
Medios de cultivo suplementados
Se prepararon seis diferentes medios de
cultivo. El medio mínimo (MM), a base de 0,6
g de NaNO ; 0,052 g de KCl; 0,202 g de
3
K H PO y 0,102 g de MgSO (SIGMA), y 40
2 2 4 4
µL de elementos traza, acorde al método
propuesto por Fernandes et al. (2012), este
medio fue la base para preparar los otros
medios. Se prepararon tres medios de cultivo
líquido de 20 mL cada uno a pH 5,6, los cuales
contenían el medio mínimo más uno de los
siguientes sustratos: glucosa 0,1 % p/v + MM
(MG), laminarina 0,1 % p/v + MM (ML) y
quitina coloidal 2 % p/v + MM (MQ), a los
cuales se les denominó “Artificiales”. Además,
se prepararon dos medios de cultivo
conteniendo el medio mínimo más uno de los
siguientes sustratos: E. melanocampta 0,1 %
p/v + MM (MEm) o P. farinosa 0,1 % p/v +
MM (MPf), a los cuales se les denominó
“Naturales”. Los medios naturales fueron
hechos a partir de larvas de E. melanocampta
secadas al horno y trituradas, de igual forma se
MATERIALES Y MÉTODOS
Spores and biomass of Beauveria bassiana
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extrajeron hojas de quinua infestadas con P.
farinosa, que fueron secadas al horno y
trituradas hasta hacerlas polvo antes de su uso
como sustratos. La preparación de quitina
coloidal se realizó de acorde al método
propuesto por Castro et al. (2010).
Posteriormente, los seis medios se
esterilizaron a 121°C por 15 min y a cada uno
de ellos se les añadió un inoculo de B. bassiana
6 -1
a una concentración de 1 x 10 esporas·mL . La
temperatura de incubación fue de 26 ± 2°C en
cabina con movimiento rotatorio de 130 rpm.
Evaluación de medios de cultivo
Se hicieron tres repeticiones para cada medio
de cultivo y se fijaron tres tiempos de
evaluación 24 h, 96 h y 216 h. Luego de cada
tiempo de cultivo se retiró del matraz 1,0 mL
del extracto crudo para realizar el conteo de
-1
esporas.mL y se midió el volumen restante
del matraz, el cual fue centrifugado en
microtubos previamente pesados para separar
la biomasa del sobrenadante. El precipitado de
cada tubo fue secado al horno a 30°C por 48 h y
pesado para su posterior evaluación de
-1
producción de biomasa en mg·ml .
Diseño experimental y Análisis de datos
En este trabajo se manejaron los datos
obtenidos en un diseño factorial de dos vías
(seis tratamientos x tres tiempos). Siendo: y =
ijk
μ + α + β+ (αβ) + є . Dónde: y = Es la
i j ij ijk ijk
variable dependiente a analizar en el í-ésimo
tratamiento (í-= (1) MM, (2) ML 0,1%; (3) MG
0,1 %; (4) MQ 2 %, (5) MEm 0,1% y (6) MPf
0,1%) del j-ésimo tiempo (j=,(1) 24 h, (2) 96 h
y (3) 216 h), en la repetición k (k=1 al 3). Las
variables dependientes fueron: (1) Número de
esporas y (2) Cantidad de Biomasa. Los datos
se acumularon en una hoja de Excel y se
analizaron en forma individual. Se realizó el
ANOVA de los tratamientos para cada tiempo
así como la comparación de medias empleando
el estadístico de Tukey (α=0,05) (Microsoft
excell 2007).
El crecimiento de las esporas de B. bassiana en
los diferentes medios de cultivo presentó
características morfológicas distintas. Algunos
medios mostraron sólo esporogénesis,
mientras que, en otros, abundaron las
ramificaciones de hifas. En el MM, B.
bassiana creció formando pequeñas esporas
sumergidas y sin presencia de hifas. En los
RESULTADOS
Figura 1. Esporas de Beauveria bassiana, en MM+Laminarina donde predominan los conidios sumergidos en gran
cantidad, sin presencia de hifa. Aumento en microscopio óptico: A) 40 X y B) 100 X.
AB
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medios denominados artificiales B. bassiana
creció de la siguiente forma: para ML se
observó predominancia de gran cantidad de
esporas sumergidos, sin presencia de hifas
(figura 1), para el MG, se observó formación
de esporas, ramificaciones de hifas y
conidiosporos y en el MQ, se obtuvo un
crecimiento de hifas y ramificaciones a partir
de las 96 h y en mayor cantidad a las 216 h. En
los medios denominados naturales, en MEm se
observó mayor presencia de masa hifal
ramificada a partir de las 24 h y poca presencia
de esporas y para MPf se observó producción
de conidios sumergidos.
El A NO VA d et er min ó d if er enc ia s
significativas (p<0,05) entre los medios de
prueba para cada uno de los tiempos
evaluados. Al realizar las comparaciones
múltiples con el estadístico de Tuckey
(α=0,05), se observaron diferencias
significativas para conidios (Figura 2) y
biomasa (Figura 3).
En la figura 2, se observa que el medio artificial
con laminarina (ML) obtuvo el mayor número
6 -1 6 -1
de esporas, (2.2 x 10 ·mL ; 59,68 x 10 ·mL y
6 -1
67,80 x 10 ·mL , a las 24 h, 96 h y 216 h,
respectivamente), mientras que entre los
medios naturales, el suplementado con polvo
de E. melanocampta (MEm) obtuvo el mayor
número de esporas a través del tiempo: 1,61 x
6 -1 6 -1
10 ·mL (24 h), 10,23 x 10 ·mL (96 h) y 18,53
6 -1
x10 ·mL (216 h).
En la figura 3 se muestra la cantidad de
-1
biomasa (mg·mL ) producida en cada medio
suplementado, observándose el máximo valor
en el medio natural MEm a las 216 h, con 8,59
-1
± 1,729 mg·mL de biomasa. Mientras que
entre los cultivos artificiales los mayores
valores se ubican a las 96 h (p<0,05) en el
-1
medio MQ con 5,085 ± 0,848 mg·mL de
biomasa.
6 -1
Figura 2. Número de esporas x10 ·mL , producidos por Beauveria bassiana a las 24 h, 96 h y 216 h en los diferentes medios de
prueba. MM= Medio mínimo; MG=Medio mínimo+Glucosa; ML= Medio mínimo+Laminarina; MQ=Medio mínimo+ Quitina
Coloidal; MEm=Medio mínimo+polvo de Eurysacca melanocampta; MPf=Medio mínimo+polvo de Peronospora farinosa.
Tukey (α=0,05).
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Spores and biomass of Beauveria bassiana
-1
Tabla 1. Cantidad de Biomasa (mg.mL ) Beauveria bassiana en los diferentes medios de cultivo, a las 24 h, 96 h y
216 h.
80
-1
Figura 3. Cantidad de biomasa (mg·mL ) producidos por Beauveria bassiana a las 24 h, 96 h y 216 h en los diferentes medios de
prueba. MM= Medio mínimo; MG=Medio mínimo+Glucosa; ML= Medio mínimo+Laminarina; MQ=Medio mínimo+
QuitinaColoidal; MEm=Medio mínimo+polvo de Eurysacca melanocampta; MPf=Medio mínimo+polvo de Peronospora
farinosa. Tukey (α=0,05).
Tiempo (h) MEDIO -1
Promedio Biomasa (mg·ml ) DS
24
MM 0,19635 0,073
MG 0,28189 0,171
ML 0,21185 0,059
MQ
1,82986 0,151
MEm
0,84557 0,121
MPf
0,44498 0,011
96
MM
0,07473 0,032
MG
0,49962 0,107
ML
0,76387 0,247
MQ
5,08515 0,848
MEm
4,64198 0,184
MPf
1,47400 1,367
216
MM
0,05926 0,011
MG
0,51667 0,034
ML
0,46500 0,032
MQ
1,78058 0,842
MEm 8,59275 1,729
MPf 0,67087 0,044
MM= Medio mínimo; MM+G=Medio mínimo+Glucosa; MM+L= Medio mínimo+Laminarina; MM+QC=Medio mínimo+QuitinaColoidal;
MM+Em=Medio mínimo+polvo de Eurysacca melanocampta; MM+Pf=Medio mínimo+polvo de Peronospora farinosa.
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glucanasas para liberar las moléculas de
glucosa. Al activarse estas glucanasas en los
hongos, ellas cumplen varias funciones entre
las cuales está la diferenciación y división
celular, el crecimiento del hongo y la
movilización de los β-glucanos (El-Katatny et
al. 2001, Viterbo et al. 2002, Ting & Chai
2014), lo cual explicaría porque en el ML este
sustrato favoreció en este estudio, el alto
número de esporas encontrados y la baja
producción de biomasa (Smith & Grula 1981,
Santa et al. 2005, Pereira et al. 2007).
Sin embargo, en el medio de cultivo MPf
(natural), aunque se ve un aumento en la
formación de esporas de B. bassiana, esta no
supera al medio MEm, ni a los medios
artificiales, ello se debe a que P. farinosa como
oomiceto presenta paredes celulósicas. La
celulosa es un polímero de glucosas, las cuales
se mantienen unidas por enlaces β-1,4-
glucosídicos, permitiendo formar cadenas
largas y lineales, unidas entre sí mediante
enlaces de hidrógeno intramolecular,
formando una estructura supramolecular
cristalina y organizada, resistente a la
hidrólisis (Chou et al. 1981, Fan et al. 1982).
Para hidrolizar a este polímero es necesaria la
acción secuencial y sinérgica de exo y endo-β-
1,4-glucanasas y de la β-1,4-glucosidasa, que
actúan en diferentes sitios para la hidrólisis
(Lee 1997) y que dan como productos
oligosacáridos, glucosa y celobiosa, siendo
esta última un inhibidor de las exo y endo-β-
1,4-glucanasas (Hahn-Hagerdal & Palmqvist
2000), lo cual trae como consecuencia la
disminución de la eficiencia de la hidrólisis y
por tanto una disminución de la fuente de
carbono (Sahab & Sabbour 2011).
El número de esporas obtenido en el medio
artificial MQ, al compararlo con los medios
MG y ML sólo alcanzó el 33,18% a las 24 h, el
8,71% a las 96 h y el 24,4% a las 216 h,
observándose además hifas muy ramificadas
desde las 24 h de cultivo. La fuente de carbono
y nitrógeno de este medio, para B. bassiana,
En la tabla 1 observamos que en el MM la
biomasa decrece con el tiempo. Dentro de los
medios artificiales encontramos que en el MG
la biomasa aumenta hasta las 96 h y se
mantiene casi sin variar hasta las 216 h;
mientras que en ML y MQ alcanzan la mayor
cantidad de biomasa a las 96 h. En los medios
naturales encontramos que el medio MEm
incrementa la cantidad de biomasa a partir de
-1
las 24 h (0,845 ± 0,121 mg·mL ) hasta las 216
-1
h (8,593 ± 1,73 mg·mL ); mientras que MPf
alcanza su mayor cantidad de biomasa a las 96
-1
h (1,474 ± 1,37 mg·mL ).
Esporas
En nuestra investigación encontramos que B.
bassiana en el medio (MM) desarrollo escaso
números de esporas, a diferencia de los medios
artificiales y naturales donde el número de
esporas se incrementó desde las 24 h hasta las
216 h, esto debido a que en estos medios
además de sales poseían otros nutrientes
necesarios para su crecimiento y desarrollo.
Beauveria bassiana en los medios de cultivo
artificiales como laminarina (ML) y glucosa
(MG) mostró un buen crecimiento de esporas
sumergidas durante los tres tiempos de
evaluación, teniendo esporas más abundantes
6
en laminarina a las 216 h (67,796 x 10
-1
esporas·mL ). Nosotros suponemos que en el
caso de glucosa, esta es una fuente de carbono
que pudo ser utilizada fácilmente por B.
bassiana en la formación de esporas, en
cambio laminarina es un polímero ramificado,
con moléculas de glucosas unidas por enlaces
β(1→3) en su cadena lineal y con moléculas de
glucosas unidas por enlaces β(1→6) en las
ramificaciones, por lo cual, para que este
sustrato pueda ser utilizado como fuente de
carbono por B. bassiana, esta debe activar sus
enzimas exo y endo β(1→3) y β(1→6)
DISCUSIÓN
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Spores and biomass of Beauveria bassiana
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fue la quitina obtenida de la caparazón de
crustáceos, la cual es un polisacárido lineal
compuesto de unidades repetitivas de
quitobiosas (N-acetil-D-glucosamina
(GlcNAc), unidas por enlace glícosidicos del
tipo ß-(1→4)) (Merzendorfer & Zimoch
2003). B. bassiana frente a este sustrato debe
inducir la actividad de sus enzimas quinasas,
las cuales presentan homología en cuanto a la
función que desempeñan en nutrición, pero
también presentan cierta actividad en el
desarrollo de los procesos de morfogénesis.
Sin embargo, el efecto inhibitorio sobre la
conidiogénesis de B. bassiana, puede deberse
a que en el medio de cultivo aumento la
concentración de los productos de la hidrólisis,
entre ellos GlcNAc, el cual es un inhibidor de
las quitinasas (St Leger et al. 1986,
Merzendorfer & Zimoch 2003, Campos et al.
2005).
El número de esporas en el medio natural MEm
fue mayor a través del tiempo, en 124% a las 24
h, 96,7% a las 96 h y 12,03% a las 216 h, al
compararlo con el medio artificial MQ. El alza
del número de esporas a las 24 h y 96 h puede
deberse a que B. bassiana tenía como sustrato a
E. melanocampta, y sabemos que los insectos
tiene como constituye principal de su cutícula
a la quitina (St. Leger et al. 1986,
Merzendorfer & Zimoch 2003, Mohanty &
Prakash 2004, Fang et al. 2005). El hecho de
que a las 216 h se vea disminuido el porcentaje
de producción de esporas puede deberse a la
presencia de altas concentraciones de GlcNAc,
pero también a la presencia de otros azúcares
y/o metabolitos que se puedan generar por el
sustrato y servir como inhibidores de las
quitinasas y otras hidrolasas. Gerding-
González et al. (2007) menciona a Kubicek et
al. (2001) y Manjula et al. (2004) quienes han
demostrado que las quitinasas tienen un efecto
inhibidor sobre la germinación de esporas de
varios hongos patógenos e hipotéticamente en
varios hongos que contienen quitina en su
pared celular.
Biomasa
Para cualquier organismo, una eficiente
producción de biomasa y de los metabolitos de
interés depende en gran medida de las fuentes
de nutrientes, su composición y un adecuado
balance entre estas fuentes. La relación
carbono-nitrógeno (C/N) es un factor
importante que afecta la formación del micelio
y del cuerpo fructífero de los hongos, aunque
se ha encontrado poco efecto sobre la
producción de intra y exo-polisacáridos (Kim
et al. 2002, Lee et al. 2007, Pham et al. 2009).
Además, la velocidad de crecimiento de B.
bassiana es típica de un hongo mesófilo y se ve
afectada por la temperatura, por lo que
presenta un crecimiento vegetativo óptimo
entre 25 y 30ºC (Sinia 2013, Romano 2013),
rango de temperatura en que se cultivó a B.
bassiana.
En el MM se obtuvo la menor cantidad de
biomasa de B. bassiana en todos los tiempos,
ello se debe a que este medio carecía de fuentes
de carbono, nitrógeno y otros factores
requeridos en la producción de biomasa,
demostrándose que un medio sólo con sales no
favorece la biomasa e inclusive diferentes
concentraciones o clases de sales no tienen un
efecto positivo sobre la producción de biomasa
(Hsieh et al. 2006).
En el MG se observó que la producción de
biomasa de B. bassiana fue 43,9% más que en
el MM a las 24 h, y de 77% a las 96 h,
permaneciendo casi invariable a las 216 h, esto
se debe a que el medio carecía de fuente de
nitrógeno, lo cual conduce a una menor
producción de biomasa como lo han
demostrado las investigaciones de Kim et al.
(2002) para el hongo Pleurotus tuber-regium
(Rumph. ex Fr.) Singer, Wu et al. (2004) para el
hongo Isaria cicadae (=Paecilomyces
sinclairii) Miq. , Lee et al. (2007) para el hongo
Ganoderma lucidum (= G. applanatum)
(Curtis) P.Karst y Torres et al. (2011) para el
hongo G. lucidum.
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Laynes et al.
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En el ML, la biomasa de B. bassiana se
incrementó 8,03% a las 24 h con respecto al
MM, y tuvo su mayor producción (0,764
-1
mg.mL ) a las 96 h, disminuyendo a las 216 h,
lo cual se puede explicar por la falta de fuente
de carbono disponible, relación C/N
adecuada, presencia de celobiosa (producto
hidrolisis) como inhibidor de las exo y endo-β-
1,4-glucanas (Lee 1997, Hahn-Hagerdal &
Palmqvist 2000), o por falto de otros nutrientes
relacionados a la producción de la biomasa, la
cual en algunas estudios demuestran que hay
una correlación negativa entre producción de
esporas y de biomasa (Gessner 1997).
Como se observa en la Tabla 1, en el MQ
(artificial) la producción de biomasa de B.
-1
bassiana se incrementó (5,085 ± 0,85 mg·mL ,
hasta las 96 h), con respecto al MM y medios
artificiales (MG, ML) y ello se debe a la
estructura del sustrato (quitina coloidal), cuyas
unidades estructurales están compuestas de N-
acetil-β-D-glucosamina (GlcNAc), las cuales
p o r m o l éc u l a t i e n e u n a r e l a c i ó n
carbono/nitrógeno de 8/1. Según Wallander et
al. (2003) dicen que la relación C/N de la
biomasa fúngica debe ser alrededor de 20/1,
sin embargo se ha encontrado que el valor
óptimo de esta relación en los medios de
cultivo usados para el crecimiento de los
hongos es específico para cada especie. Así por
ejemplo, se han encontrado como relaciones
óptimas para la producción de biomasa
micelial de hongos, relaciones C/N de 20/1
para Isaria cicadae, 24/1 para P. tuber-regium,
de 40/1 para Antrodia cinnamomea Chang &
Chou e incluso de 129/1 para G. lucidum (Lin
& Chen 2007, Lee et al. 2007, Kim et al. 2002,
Wu et al., 2004). La disminución de la biomasa
a las 216 h se explica porque las enzimas que
hidrolizan este sustrato (quitinasas) son
inhibidas por altas concentraciones de
GlcNAc, que se deben estar liberando al
medio. Además que otras investigaciones han
demostrado que estas enzimas inhibe el
alargamiento del tubo germinativo (Manjula et
al. 2004) y produce lisis en los extremos de las
hifas (Ordentlich et al. 1988).
El crecimiento de B. bassiana en el MPf
(natural) produjo más biomasa que el MM,
pero frente a los medios artificiales MG y ML,
su comportamiento fue de baja producción de
biomasa, ello se explica porque P. farinosa en
sus paredes contiene celulosa, que es resistente
a la hidrólisis (Ljungdahl & Eriksson 1985) y
que uno de sus productos de hidrólisis, la
celobiosa es un inhibidor de las exo y endo
glucanasas que ayudan a degradar a este
polímero (Lee 1997).
En el medio suplementado con E.
melanocampta (MEm) la producción de
b i o m a s a p a r a B . b a s s i a n a f u e
significativamente mayor (p>0,05) a las 216 h
-1
(8,593 mg·mL biomasa), al compararla con
los otros medios de esta investigación. La
diferencia con el MQ es que este medio
contenía como sustrato quitina de crustáceos la
cual es ligeramente diferente, ya que mientras
los grupos acetilo de la quitina de crustáceos se
distribuye uniformemente a lo largo de la
cadena polimérica, la quitina aislada de la
cutícula de insectos (Merzendorfer & Zimoch
2003) y de las paredes celulares de los hongos
contienen los residuos de acetilos concentrados
en ciertos puntos del polímero. Hernández et
al. (2008) observaron que su contenido de
nitrógeno puede varia de 5 % a 8 % en función
del grado de desacetilación. La degradación
enzimática de la quitina produce una mezcla de
quito-oligosacáridos de diferente tamaño y
características (Struszczyk & Struszczyk
2007). Por lo tanto, nosotros suponemos que en
el MEm los productos de hidrólisis
favorecieron la producción de biomasa, debido
a que alcanzo una adecuada relación de C/N y
los nutrientes necesarios para su crecimiento.
El cultivo de B. bassiana in vitro suplementado
con sustratos como laminarina, quitina
coloidal y E. melanocampta inducen un
incremento del número de esporas y de
biomasa.
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Received November 7, 2015.
Accepted February 26, 2016.
