The Biologist
(Lima)
VOL. 18, Nº 1, JAN-JUN 2020
The Biologist (Lima)
Versión en Linea:
ISSN 1994-9073
Versión Impresa:
ISSN 1816-0719 Versión CD-ROM:
ISSN 1994-9081
PUBLICADO POR:AUSPICIADO POR:
ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA,
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMÁTICA,
UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL
The Biologist
(Lima)
The Biologist (Lima), 2020, 18(1), jan-jun: 49-53.
RESEARCH NOTE /NOTA CÍENTIFICA
MOLECULAR IDENTIFICATION OF LEISHMANIA IN DIDELPHIS MARSUPIALIS LINNAEUS, 1758
OF UCAYALI, PERU
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEISHMANIA EN DIDELPHIS MARSUPIALIS LINNAEUS, 1758
DE UCAYALI, PERÚ
1 Facultad de Ciencias, Universidad Continental, Lima, Perú
Corresponding Author: jesus.rojas.jaimes@gmail.com
1
Jesús Rojas-Jaimes
ABSTRACT
The aim of this study was to molecularly identify Leishmania sp. in a specimen of Didelphis marsupialis
Linnaeus, 1758 in the Ucayali Region, Peru. Samples of kidney, liver and spleen were taken, DNA was
extracted from the samples to be analyzed for the DNA kinetoplast and to identify Leishmania sp. but the
parasite was not found.
The Biologist (Lima)
ISSN Versión Impresa 1816-0719
ISSN Versión en linea 1994-9073 ISSN Versión CD ROM 1994-9081
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doi: 10.24039/rtb2020181445
RESUMEN
Palabras clave: Leishmania– marsupial – reservorio – silvestre
El presente estudio tuvo como objetivo identificar molecularmente a Leishmania sp. en un ejemplar de
Didelphis marsupialis Linnaeus , 1758 en la Región Ucayali, Perú. Se tomaron muestras de riñón, hígado y
bazo, se extrajo ADN de las muestras para ser analizadas para el kinetoplasto del ADN e identificar
Leishmania sp. pero no se logró identificar al parásito.
Keywords: Leishmania– marsupial – Reservoir – wild
La leishmaniasis ocasionada por el parásito
Leishmania sp. es una enfermedad infecciosa de
importancia en Salud Pública que genera,
adicionalmente al daño tisular, un daño psicosocial
debido al estigma que se genera al paciente
(Schallig et al., 2007). La presentación de la
enfermedad requiere de varios factores
involucrados, incluyendo el reservorio del parásito
(WHO, 2010).
Se sugiere que Didelphis marsupialis Linnaeus,
1758, un marsupial americano, se comporta como
un reservorio de Leishmania braziliensis Lainson-
Jaimes 1974 en zonas rurales, habiéndose
identificado en muestras sanguíneas en Brasil,
tanto por serología como por pruebas de detección
de ADN (Cabrera et al., 2003; Schallig et al.,
2007). Así mismo, fue identificado L. chagasi
Cunha & Chagas, 1937 en D. marsupialis en
Colombia utilizando técnicas moleculares (Roa et
al., 2002), lo que indica la importancia de este
marsupial en el ciclo de leishmaniasis visceral.
Adicionalmente, se ha comprobado la infección en
laboratorio de L. chagasi en D. marsupialis (Travi
et al., 1994; Roa et al., 2002; Zambrano et al.,
2016).
El pequeño marsupial D. marsupialis se distribuye
ampliamente en las Américas en casi todos los
hábitats, a excepción de las zonas altas y desiertos,
y su población está relacionada a la disponibilidad
de alimentos como frutas y pequeños
invertebrados. En el Perú se encuentra en las zonas
rurales, donde hay presencia de leishmaniasis
(Emmons & Feer, 1990; William et al., 2008;
Lozada et al., 2015).
El objetivo del presente estudio fue identificar
molecularmente la presencia de Leishmania sp. en
un ejemplar de D. marsupialis en el distrito de
Raymondi, Ucayali, Perú.
El ejemplar macho fue ubicado en agosto del 2017
en la comunidad nativa Aerija, distrito de
INTRODUCCIÓN
50
Raymondi, provincia de Atayala, región de
Ucayali, Perú, coordenadas 10°44′00″S
73°45′00″O. El encuentro con el animal fue
ocasional, siendo un especimen que sería utilizado
para el consumo de la población local. Se tomaron
muestras de hígado, bazo y riñón utilizando
instrumental estéril (Rojas-Jaimes et al., 2017).
Los tejidos fueron colocados en frascos estériles
con etanol al 96%. Los tejidos fueron cortados en
secciones de 0,1 cm, colocados en un microtubo de
1,5 mL al cual se le añadió 300 µL de solución de
lisis celular que contenía Dodecilsulfato Sódico en
el tubo. Se adicionó 20 µL de proteinasa K y se
mezcló suavemente, luego se centrifugó, solo si fue
necesario, y el tubo se incubó a 55 ºC durante toda
la noche. Luego se añadió 100 µL de la solución
hipertónica para precipitación de proteínas, se
agitó vigorosamente durante 20 s y se centrifugó
durante 10 min a 13 000 rpm. El sobrenadante se
mezcló con 300 µL de isopropanol frio y se agitó
suavemente por inversión por más de 50 veces; se
centrifugó durante 10 min a 13 000 rpm, y se colocó
en el congelador durante 1 h a -10 °C. Paso seguido,
se desechó el sobrenadante y se colocó el tubo
invertido en papel toalla y se dejó secar al aire
durante 5 min. Se añadió 60 µL de solución de
hidratación “agua grado biología molecular” y se
agitó por 5 s. Finalmente se incubó a 65 ºC durante
1 h para solubilizar el ADN (QIAGEN, 2017).
Se utilizó un PCR-kDNA para la detección de
Leishmania. Los cebadores usados fueron -MP1-L
(directo) 5'-TAC TCC TGC CCG ACA CTC TG-3
y MP3-H (reverso) 5 'CGG GGT GAA TTC TGT
ATG C-3' (López et al., 1993). El ADN de control
u sa d o fue L . ( V) b r a z i l i e n s i s c e pa
MHOM/BR/84/LTB300 y ADN humano a partir de
muestras negativas para la leishmaniasis.
Para cada reacción de PCR se usó un control
positivo para L. (V) braziliensis (cepa LTB300), un
control negativo que consiste en ADN humano
positivo para el gen de la globulina y un blanco
(agua destilada, grado PCR) para revelar la
contaminación cruzada. Las reacciones se llevaron
a cabo en un volumen final por reacción de 20 µl
que contiene 4 DNA µl, 2 µl de tampón 10X PCR
(Invitrogen), 1 µl de cada cebador (10 µM), 0.2 µl
de Taq ADN polimerasa (5 U/µl) (Invitrogen,
Grand Island, NY), 0.6 µl de 50 mM de MgCl y 2
2
µl de 1.25 mM de cada dNTP (Lopez et al., 1993).
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MATERIALES Y MÉTODOS
Rojas-Jaimes
Las condiciones del termociclaje usadas en el
termociclador GeneAmp ® PCR System 9700
según la programación fueron: desnaturalización
inicial a 94 °C durante 5 min y 35 ciclos incluyendo
desnaturalización: 94 °C durante 45 s, hibridación
de cebadores a 58 °C durante 45 s; extensión: 72 °C
durante 1 min; y temperatura final de extensión: 72
°C durante 5 min. Después se refrigero a 4 °C hasta
su uso para preservación del amplicón.
Se preparó un gel de agarosa al 1,5% (3 g de
agarosa con 197 ml de buffer TBE 1X). Se utilizó
un marcador de peso molecular de 50 pb a 250 pb
(Invitrogen). Se colocó 5 µl de los productos de la
PCR y 3 µl del marcador de corrida por pocillo. La
corrida electroforética se realizó sobre el buffer
TAE 1X a un voltaje constante de 100V durante 35
min. El gel fue sumergido en una solución de
bromuro de etidio a una concentración de 0.5
mg/ml por 30 min (López et al., 1993).
RESULTADOS
51
La presencia de una banda de 70 pb, cuando es
comparada con el control positivo y con el
marcador de peso molecular de 50 a 250 pb indica
un resultado positivo.
Aspectos éticos: El animal fue sacrificado por la
población nativa para autoconsumo, por tanto se
aprovechó la ocasión para tomar las muestras en
forma asépticas, respetando las normas éticas y
resguardando los nombres de las personas que
realizaron la caza.
La Fig. 1 nos señalan los resultados de la Reacción
en Cadena de la Polimerasa para detectar
Leishmania sp. en D. marsupialis.
Figura 1. Reacción en Cadena de la Polimerasa para detectar Leishmania sp. PCR-kDNA del riñón, bazo e hígado para la
identicación de Leishmania sp. De izquierda a derecha, primer carril: marcador de peso molecular de 50-250 pb; carriles del 2-4:
muestras negativas; carriles del 5-7: controles positivos y carril 8: blanco negativo.
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Molecular identication of Leishmania
Las pruebas moleculares de los tejidos viscerales
resultaron negativas para la detección de
Leishmania sp. (figura1), cabe destacar que solo
fue un animal muestreado y no se puede descartar
la parasitosis en este animal más aun cuando existe
varios estudios previos que han mostrado la
presencia del parasito en D. marsupialis (Lainson
et al., 1989 ab; Emmons et al., 1990; Cabrera et al.,
2003).
Leishmania es un parásito que se encontrado en
forma natural infectando fauna silvestres como
infectando animales en ensayos in vivo (Yoshida et
al., 1985; Travi et al., 1994; Williams et al., 2008).
De esto se destaca la posibilidad que el parásito
puede parasitar un amplio número de reservorios
contribuyendo al ciclo de la enfermedad (Yoshida
et al., 1985). Es importante saber que la población
local utiliza la carne de D. marsupialis para
consumo atribuyendo a este alimento algunas
propiedades medicinales. Como se pudo observar
el consumo de carne de este marsupial puede
generar parasitosis, si la carne no se encuentra bien
cocida o por un accidente mecánico en la exista
intercambio de fluido como la sangre entre el
marsupial y la persona (Yoshida et al., 1985; Travi
et al., 1994; Andrade et al., 2015; Zambrano et al.,
2016).
Se concluye que no se identificó Leishmania sp. en
las vísceras estudiadas de D. marsupialis,
probablemente por el numero escaso de muestra
que es una limitación de nuestro estudio,
remarcando que otro estudio si encontró a
Leishmania en el marsupial (Zambrano et al.,
2016)..
DISCUSIÓN
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Received July 28, 2019
Accepted January 30, 2020.
The Biologist (Lima). Vol. 18, Nº1, jan - jun 2020
Molecular identication of Leishmania