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ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL
BEHAVIOR OF REFUGE AND ACTIVITY OF THE CEREBRAL ACETYLCOLINESTERASE IN
GAMBUSIA PUNCTATA (POEY, 1854) (POECILIIDAE) BY BIOAVAILABLE LEAD
COMPORTAMIENTO DE REFUGIO Y ACTIVIDAD DE LA ACETILCOLINESTERASA CEREBRAL
EN GAMBUSIA PUNCTATA (POEY, 1854) (POECILIIDAE) POR PLOMO BIODISPONIBLE
1 Centro de Investigaciones Avanzadas y formación Superior en Educación, Salud y Medio Ambiente ¨AMTAWI¨, Perú.
george.argota@gmail.com
2 Universidad de Ciencias Médicas. Centro de Toxicología y Biomedicina ¨TOXIMED¨. Santiago de Cuba, Cuba.
irela.perez@infomed.sld.cu
3 Laboratorio de Ecología y Biodiversidad Animal. Facultad de Ciencias Naturales y Matemática. Universidad Nacional
Federico Villarreal (UNFV), Perú. joseiannacone@gmail.com
4 Laboratorio de Cordados. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Ricardo Palma (URP), Perú.
5 Facultad de Tecnología de Salud «Julio Trigo López». Universidad de Ciencias Médicas ¨Dr. Serafín Ruiz de Zárate Ruiz¨.
Villa Clara, Cuba. rigobertofd@infomed.sld.cu
ISSN Versión Impresa 1816-0719
ISSN Versión en linea 1994-9073 ISSN Versión CD ROM 1994-9081
ABSTRACT
The purpose of the study was to evaluate the behavior of shelter and the activity of cerebral
acetylcholinesterase (AChE-cerebral, EC: 3.1.1.7) in the species Gambusia punctata (Poey, 1854) by
bioavailable lead. The water matrix of the San Juan ecosystem of Santiago de Cuba-Cuba was sampled by
selecting a composite sample (1: 1: 1) from three points corresponding to the lower part of this ecosystem.
Then the reaction time-refuge of G. punctata, the activity of the AChE-brain by action of the bioavailable
lead concentration for the control and experimental treatment group was tested for 21 days at 25 °C. The
reaction-refuge time was delayed and the enzymatic activity of the AChE-brain was elevated. A greater
bioaccumulation of brain Pb was observed in the experimental group. It is concluded that the refuge
behavior was possibly reduced due to the increase in the activity of the AChE-cerebral enzyme, according
to bioaccumulation of the Pb, indicating a biological anomaly.
Keywords: cerebral acetylcholinesterase – ethology – Gambusia punctata – lead
The Biologist (Lima)
The Biologist
(Lima)
The Biologist (Lima), 201 , 1 ( ), - : 8 6 1 ene jun 171-179
1 2 3,4
George Argota-Pérez ; Irela Y. Pérez-Andrés ; José Iannacone ;
3 5
Lorena Alvariño & Rigoberto Fimia-Duarte
172
RESUMEN
El propósito del estudio fue evaluar el comportamiento de refugio y la actividad de la acetilcolinesterasa
cerebral (AChE-cerebral; EC: 3.1.1.7) en la especie Gambusia punctata (Poey, 1854) ante
concentraciones de plomo biodisponible. Se muestreó la matriz agua del ecosistema San Juan de Santiago
de Cuba-Cuba seleccionando, una muestra compuesta (1:1:1) de tres puntos correspondientes a la parte
º
baja de este ecosistema. Luego se ensayó durante 21 días a 25 C, el tiempo de reacción-refugio de G.
punctata, la actividad de la AChE-cerebral por acción del plomo biodisponible para el grupo de
tratamiento control y experimental. El tiempo de reacción-refugio fue retrasado y la actividad enzimática
de la AChE-cerebral fue elevada. Se observó, mayor bioacumulación del Pb cerebral en el grupo
experimental. Se concluyó que el comportamiento de refugio estuvo disminuido posiblemente, al
aumento de la actividad de la enzima AChE-cerebral, según bioacumulación del Pb, indicando anomalía
biológica.
Palabras clave: acetilcolinesterasa cerebral – etología – Gambusia punctata – plomo
INTRODUCCIÓN
El vertimiento de efluentes con alta presencia de
elementos químicos provoca eutrofización en los
ecosistemas acuáticos, disrupción endocrina que
inducen a la feminización en peces machos
(Pettersson et al., 2006), madurez sexual retrasada
(Lars et al., 2006) y efectos bioacumulativos
(Zargar et al., 2017), entre otros. Los metales como
elementos químicos, alteran la composición físico-
química de la columna de agua y los sedimentos,
además, perjudican el valor biológico de las
poblaciones y comunidades en los ecosistemas
(Richetti et al., 2011; Sabullah et al., 2015; Ching
et al., 2016; Kalogianni et al., 2017).
Para evaluar el valor biológico en los ecosistemas,
es necesario establecer un enfoque integrado de
monitoreo ambiental sobre los propios parámetros
físico-químicos de calidad en forma simultánea
con el uso de algunos indicadores biológicos
(Costa et al., 2017), como pueden ser el coeficiente
de condición (Jurajda, 2009), reproducción
mediante el índice gonadosomático (Marcogliese
& Pietrock, 2017), tolerancia y resistencia hacia la
parasitosis (Sitja, 2008; Shah et al., 2014),
citotoxicidad y alteración del sistema
inmunológico de los peces (Risjani et al., 2014),
entre otros.
El pez Gambusia punctata (Poey, 1854)
(Poeciliidae) se distribuye de forma natural en los
ambientes lóticos de Cuba, formando parte del
control biológico contra larvas de culícidos y
pueden ser empleado como un biomonitor a
sustancias tóxicas como son los metales pesados
(Argota et al., 2016; Bourzat et al., 2017).
Los biomarcadores enzimáticos son ampliamente
usados en los ecosistemas acuáticos para evaluar la
exposición y el efecto de los tóxicos sobre los peces
de modo que, pueden ser considerados como
herramientas de advertencia temprana a la
contaminación (Torre et al., 2007; Vieira et al.,
2009; Sabullah et al., 2015). Al ser expuestos los
organismos vertebrados e invertebrados a la
contaminación, la actividad de la enzima
acetilcolinesterasa (AChe; EC: 3.1.1.7), está entre
los marcadores más empleados en el ambiente
acuático (Vieira et al., 2009; Richetti et al., 2011;
Sabullah et al., 2015; Bonansea et al., 2016; Rani et
al., 2017).
La AChe cataliza la hidrólisis del neurotransmisor
acetilcolina en colina y ácido acético sobre la
sinapsis colinérgica en el sistema nervioso (Jebali
et al., 2013). Esta enzima puede ser inhibida por
plaguicidas organofosforados y carbamatos así
como, por metales pesados (Rendón-von Osten et
al., 2005; Jebali et al., 2013; Bonansea et al., 2016;
Fergani & Arab, 2017). La presencia de algunos
plaguicidas y metales como el plomo en órganos
dianas de los peces pueden alterar la actividad
enzimática de la AChe en hígado, músculo y
cerebro (Rao et al., 2005; Rendón-von Osten et al.,
2005; Jebali et al., 2013; Al-ghais, 2013; Argota et
al., 2013ab). Sabullah et al. (2015), resumen el uso
The Biologist (Lima). Vol. 16, Nº1, ene - jun 2018
Argota-Pérez et al.
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antes del estudio (sin alimentación y oxigenación
constante). Se colocaron 40 individuos en dos
peceras de cristal (cada una con réplica),
conteniendo un volumen inicial de agua no
-1
contaminada (1L·individuo ). Luego se ensayó la
-1
muestra compuesta (1,5L·individuo ) por 21 días,
º
bajo temperatura controlada del agua a 25 C,
midiendo al final del ensayo, el tiempo de
comportamiento de refugio de los individuos
mediante la introducción de una varilla esterilizada
(vidrio), observando el tiempo de la conducta en
huida-refugio de los peces hacia las plantas y
piedras que fueron ubicadas en las peceras, la
actividad de la acetilcolinesterasa cerebral (AChE-
cerebral) y finalmente la concentración de Pb
cerebral.
Para la medición de la temperatura se utilizó el
termómetro: TDS Meter 3 - Digital Water Quality
Tester mientras que, la concentración de Pb en
cerebro se midió por espectrometría de plasma
inductivamente acoplado con vista axial (ICP-
AES), realizándose la lectura de las muestras en
matriz de digestión ácida (Argota et al., 2016).
La actividad AChE-cerebral (μmol/min/mg de
tejido) se midió mediante espectrofotómetro
(Perkin-Elmer UV/VIS) a 410 nm, realizándose
todos los análisis por triplicado. Inicialmente, las
muestras se homogenizaron en una solución
amortiguadora TRIS/HCL 0,1M, 0,1% Triton pH-8
en el ratio de 1mL por 0,5g de tejido,
centrifugándose a 1000 rpm por 12 min (Ellman et
al., 1961). Se empleó como substrato,
acetiltiocolina yodada y la detección de la
liberación de tiocolina mediante reacción con 5,5-
dithiobis (ácido 2-nitrobenzoico) (Argota et al.,
2013a). Después de 5 min se registró la actividad
AChE-cerebral. En el caso del tiempo de reacción
se midió con el cronómetro Casio Collection-
Digital: HS-3V-1RET.
Análisis estadístico de los datos
Para el tratamiento de los resultados se aplicó como
métodos estadísticos, la prueba t-Student para
determinar diferencias y estimaciones
significativas entre el control y el experimental
(Montgomery, 1991). Los análisis estadísticos se
realizaron mediante el software profesional:
Statgraphics Centurion XVI considerando
significativos los resultados, a un nivel de
confianza del 95% (p≤ 0,05).
de la AChe para el monitoreo ecotoxicológico de
metales pesados en varias especies de peces.
El plomo es un metal pesado persistente tiene como
importantes fuentes de emisión antropogénica, la
actividad minera, pinturas, agricultura, industrias
de alimentos y vidrio entre otras, las cuales vierten
estos químicos de forma directa o indirectamente
hacia las aguas (Authman et al., 2015; Sabullah et
al., 2015). El plomo tiene efectos bien conocidos
en la salud sobre el sistema de neurotransmisores y
es un probable carcinógeno a los humanos.
Además, es conocido el rol del aumento de esta
enzima en enfermedades degenerativas como el
Alzheimer y en poblaciones envejecidas (Richetti
et al., 2011).
Efectos no letales por exposición bioacumulativa
al plomo pueden ser evaluados mediante
bioensayos consiguiendo describirse finalmente,
algunas respuestas específicas como las
conductuales (Steffens et al., 2015; Hansen &
Unruh, 2017). El comportamiento locomotorio en
peces puede ser afectado por diversos
contaminantes, ocasionando disminución en la
capacidad de los peces para escapar de los
depredadores, capturar presas y en la reproducción
(Rao et al., 2005; Vieira et al., 2009; Sabullah et al.,
2015). Variaciones en el conducta como el
comportamiento natatorio en peces se encuentran
entre los biomarcadores conductuales más usados a
nivel individual, debido a que esta respuesta
integra muchos procesos celulares (Bonansea et
al., 2016).
El propósito de este estudio fue evaluar el
comportamiento de refugio y actividad de la
acetilcolinesterasa cerebral en G. punctata
(Poeciliidae) por plomo cerebral biodisponible.
Se analizó una muestra compuesta (proporción
1:1:1) de la matriz agua correspondiente a tres
puntos de exposición (A- X: 607810, Y: 150770; B-
X: 607350, Y: 149645; C- X: 606 945, Y: 147516)
en la parte baja del ecosistema San Juan de
Santiago de Cuba, Cuba. Previamente, ejemplares
de la especie G. punctata fueron aclimatados 24h
MATERIALES Y MÉTODOS
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Effect of bioavailable lead on Gambusia
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La tabla 1 muestra el resumen estadístico del
tiempo de reacción ante el estímulo de G. punctata
de la actividad AChE-cerebral y las
concentraciones de Pb en el grupo de tratamiento
control y experimental.
Ética de la investigación
La eutanasia de los peces se realizó mediante
bolsas con hielo que fueron depositadas en
diferentes recipientes de cristal con agua tratada,
procurando que durante la inmersión de los
ejemplares fueran tranquilizados para su disección,
análisis de la AChE-cerebral y plomo
bioacumulado en cerebro (NRC, 2017).
Tabla 1. Resumen estadístico del tiempo de reacción ante el estímulo (seg), AChE-cerebral (μmol/min/mg), y Pb-
º
cerebral(µg/g) en Gambusia punctata a 25 C por 21 días de exposición.
Estadígrafos Reacción ante
estímulo
control
Reacción
ante
estímulo
experimental
AChE
control AChE
experimental Pb
control
Pb
experimental
promedio 0,98 3,15 127,36 331,29 1,04 1,54
±0,04 ±0,58 ±1.26 ±3,22 ±0,004 ±0,003
Coeciente de variación (%) 4,96 18,63 0,99 0,97 10,52 5,03
IC al 95% 0.90, 1,10 2,0, 4,0 124,87, 129,84 328,80, 333,77 0,75, 1,24 1,25, 1,74
sesgo estandarizado -0,80 -0,007 -0,48 1,73 -1,18 0,87
Sig. de t de student * * *
*= Indican valores signicativos a un nivel de signicancia de 0,05.
Se encontró que el tiempo promedio del
comportamiento de refugio de G. punctata en el
grupo control fue menor que en el experimental,
observándose en este último, mayor actividad de la
AChE-cerebral y acumulación al plomo en el
cerebro. Yang et al. (2017) observaron,
disminución de la respuesta de comportamiento en
el pez Danio rerio (Hamilton-Buchanan, 1822) a
concentraciones de cadmio en el agua en
comparación al control a 48 h de exposición. De
igual forma se observó, disminución de la actividad
de la AChE-cerebral con el aumento de la
concentración de cadmio en el agua (Yang et al.,
2017). En el presente trabajo se observó un patrón
diferente, pues hubo mayor actividad de la AChE-
cerebral y acumulación al plomo en el cerebro de
G. punctata. La mayoría de las investigaciones
muestra una disminución de la AChE-cerebral con
al aumento en la concentración de metales pesados
y sitios contaminados a tiempos cortos de
exposición (Jebali et al., 2013; Rani et al., 2017;
Yang et al., 2017). Aunque no se evaluaron
concentraciones de otros tóxicos (incluyendo a los
Dado que el sesgo estandarizado para las
determinaciones se encontró entre -2 a +2, se
indicó que las distribuciones de los datos
correspondieron a la normalidad lo cual, no
invalidó la prueba de comparación de medias para
el tiempo de reacción ante el estímulo, la AChE-
cerebral y concentración de Pb en G. punctata. El
intervalo de confianza mostró, diferencias
estadísticamente significativas entre los valores
promedios del tiempo de reacción ante el estímulo,
de la AChE-cerebral y Pb cerebral entre el grupo
control y experimental (Tabla1).
Al finalizar el ensayo se observó que, el tiempo
promedio del comportamiento de refugio en la G.
punctata para el grupo de tratamiento control
resultó menor que el grupo de tratamiento
experimental, así como mayor actividad de la
AChE-cerebral y bioacumulación al plomo en el
tratamiento experimental a la misma temperatura
pudiendo indicarse su efecto directo en la
movilización desde la matriz agua hacia el
organismo (Tabla 1).
The Biologist (Lima). Vol. 16, Nº1, ene - jun 2018
Argota-Pérez et al.
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bioacumulación al plomo en el cerebro como
órgano diana (Biol et al., 2013; Madeira et al.,
2013; Luísa et al., 2017).
La exposición a compuestos aromáticos
policíclicos (Oropesa et al., 2007) y pesticidas
(Topal et al., 2017) en las aguas puede provocar
disminución de la AChE-cerebral en peces.
Sanches et al. (2017) probaron que, el plomo
muestra un alto factor de bioconcentración y
aunque solo se midió la concentración en tejido
biológico y no en el agua, se corrobora lo planteado
en el presente estudio.
Resultó valorativo que si la especie G. punctata
mostró daños y ha sido considerada como
biomonitor para la predicción de riesgo en
ecotoxicología acuática (Argota & Iannacone,
2017), entonces otras especies más sensibles,
podrán manifestar disímiles efectos que se
clasificarían desde magnitudes de daños leves
hasta severas, incluyendo la propia muerte del
organismo.
Sfakianakis et al. (2015), señalan que los metales
pes ados s e han asociad o con diversa s
deformaciones en los peces. Boglione et al. (2013)
indican la aparición de efectos no deseados sobre la
tasa de crecimiento, bienestar y morfología
externa, así como la supervivencia poblacional
(Boglione et al., 2013). Algunas de las
deformaciones más comunes se localizan en la
columna vertebral (Koumoundouros et al., 2002;
Sfakianakis et al., 2006), vejiga natatoria
(Divanach et al., 1996) y en las aletas (Favaloro &
Mazzola, 2003). Cuando los peces presentan
cualquiera de estas deformaciones, sin duda
alguna, aumenta la vulnerabilidad en la captura
sobre presas, el apareamiento o la protección ante
posibles depredadores.
Todo organismo en estado fisiológico normal,
manifiesta una respuesta o un patrón de
conservación ante cualquier estímulo que
represente un peligro donde tal conducta, es
condicionada por el sistema nervioso (Bonansea et
al., 2016). Georgakopoulou et al. (2007) refirieron
que, la exposición a metales induce del mismo
modo, deformaciones en la región cefálica y no
solo son morfológicas externas, pues algunos
daños sobre estructuras anatómicas internas
también se manifiestan. Una posible respuesta de
metales) en la muestra de agua integrada (1:1:1)
que se expusieron a G. punctata, éstos pudieran
ocasionar efectos de mezcla con el plomo
produciendo, aumento de la actividad de la AChE-
cerebral a 21 días de exposición. Şen & Karatuğ
(2017) observaron, estimulación de la actividad de
la AChE-cerebral con el incremento de las
concentraciones de los metales pesados: plomo y
selenio en los tejidos de la tilapia Oreochromis
niloticus (Linneaus, 1758) a 15 días de exposición.
El uso de la actividad de la AChE-cerebral es un
b i o m ar c a d or amb i e n tal qu e r e q u ie r e ,
caracterización cuidadosa de las enzimas presentes
en la especie íctica como en el tejido del pez, para
minimizar la interpretación errada de los resultados
(Jebali et al., 2013). Fergani & Arab (2017) señalan
que, la actividad de la AChE-cerebral varía
dependiendo del sexo, parámetros intrínsecos del
pez y del tejido estudiado.
La mayoría de los registros en la literatura señalan
que, la disminución de la actividad de la AChE-
cerebral por acción de tóxicos ambientales altera el
comportamiento natatorio en los peces (Vieira et
al., 2009; Lima et al., 2013; Bonansea et al., 2016;
Fergani & Arab, 2017). Bonansea et al. (2016)
expresan que el comportamiento de nado, la
hipoactividad como la hiperactividad en los peces
puede estar asociada con inhibición de la actividad
de la ACHe-cerebral a tiempos cortos de
exposición. Los resultados hallados muestran,
disminución del comportamiento de refugio de G.
punctata con un aumento de la actividad de la
ACHe-cerebral a mayor tiempo de exposición de
21 días para una muestra ambiental de río que
pudiera tener otros tóxicos en mezcla con el plomo
(Yang et al., 2017).
Pouil et al. (2017) en su estudio sobre Zn dietético y
el subsiguiente organotropismo en los peces,
experimentaron con valores de pH en el rango de la
neutralidad (7,5 y 8,0), así como con dos niveles de
º º
temperatura: 17 C y 20 C, hallándose que los
parámetros no influyeron en la transferencia de Zn
hacia un órgano en particular. Sin embargo, el Zn es
un elemento esencial en la vida de los vertebrados
donde es regulado por la homeostasia, no siendo así
para el plomo, pues no juega un papel biológico
reconocido; y aunque no se medió el pH en la
muestra compuesta, la temperatura ensayada fue
º
5 C superior a la máxima del estudio comparado
d o n d e s e o b s e r v ó , r e l a c i ó n s o b r e l a
The Biologist (Lima). Vol. 16, Nº1, ene - jun 2018
Effect of bioavailable lead on Gambusia
176
los peces cuando presentan daños cerebrales,
quizás esté asociada con determinado acto reflejo
en forma demorada, pudiendo ser observado tal
conducta en los organismos de la especie G.
punctata que por lo general, en el grupo de
tratamiento experimental se mantuvieron en el
tercio superior de la columna de agua, siendo dicha
conducta no esperada, ya que estos peces suelen
quedar únicamente en este nivel, durante la
b ú s q u e d a d e p r e s a s ( e j . : i n s e c t o s y
microcrustáceos). Bonansea et al. (2016) señalan
que, los peces ante exposiciones bajas de
determinado tóxico, prefieren la parte alta en el
acuario y cuando las concentraciones del tóxico
son elevadas, entonces prefieren el área superior.
Asimismo, la forma percoidea de su cuerpo, les
garantiza la pronta huida por competencia del
alimento (Argota et al., 2013); además, poder
escapar ante cualquier estímulo que represente un
peligro de modo que, el tiempo de reacción-refugio
en los organismos del grupo de tratamiento
experimental fue significativo, atendiendo a los
valores encontrados.
Jonge et al. (2015) señalaron que, la cuantificación
de metales en los tejidos de las especies residentes
(como es la G. punctata en el ecosistema San Juan)
representa una imagen integrada y ecológicamente
relevante sobre la biodisponibilidad específica de
cualquier metal en un determinado nicho
ecológico, existiendo tal condición química en este
estudio experimental, ya que hubo bioacumulación
del plomo.
Aunque el Pb puede bioacumularse en los
organismos acuáticos mediante el agua y la dieta,
existen evidencias que la mayor probabilidad sea, a
través de las aguas contaminadas (Cretì et al.,
2010) siendo evidenciado en el presente estudio.
Finalmente, Mager (2011) mencionó que, entre los
principales efectos por bioacumulación al plomo
en los peces se encuentran los daños hematológicos
y neurológicos por cuanto, la concentración
elevada de la AChE-cerebral como biomarcador de
efecto, indicó este último daño.
Se concluyó que, la disminución etológica de
refugio resultó una señal de anomalía ante la
concentración de Pb cerebral a la temperatura de 25
ºC, lo que se asoció a una actividad no deseada de la
enzima AChE-cerebral.
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Received October 4, 2017.
Accepted February 9, 2018.
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