New pathogenic variant in the SOX9 gene related to campomelic dysplasia 171 T e Biologist (Lima). Vol. 22, Nº2, jul - dec 2024 T e Biologist (Lima) T e Biologist (Lima), 2024, vol. 22 (2), 171-178 ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL BIOREMEDIATOR EFFECT OF FILAMENTOUS FUNGI OF CITRUS X SINENSIS IN SOIL CONTAMINATED WITH GASOLINE EFECTO BIORREMEDIADOR DE LOS HONGOS FILAMENTOSOS DE CITRUS X SINENSIS EN SUELO CONTAMINADO CON GASOLINA Angela Cánepa-Carbajal 1* , Camila de la Cruz 1 & César Lozano-Lévano 1 ISSN Versión Impresa 1816-0719 ISSN Versión en línea 1994-9073 ISSN Versión CD ROM 1994-9081 Este artículo es publicado por la revista T e Biologist (Lima) de la Facultad de Ciencias Naturales y Matemática, Universidad Nacional Federico Villarreal, Lima, Perú. Este es un artículo de acceso abierto, distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Atribución 4.0 Internacional (CC BY 4.0) [https:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/deed.es] que permite el uso, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada de su fuente original. DOI: https://doi.org/10.62430/rtb20 242221824 o VOL. 22. N 2, JUL-DIC 2024 Universidad Nacional Federico Villarreal ABSTRACT Hydrocarbon contamination is one of the main causes of infertility in areas, leaving very critical levels for the ecosystem, reaching the point of being considered as one of the most concurrent problems due to the uncontrolled management of these by the industrial and productive sectors. T at is why new strategies have been formulated as a more reliable alternative in situations of response to hydrocarbon spills, with bioremediation with fungi and bacteria being the most ef cient strategy. T at is why this study aimed to determine the bioremediation ef ect of f lamentous fungi ( Aspergillus , Penicillium , Geotrichum , and, Rhizopus ) in soil contaminated with 90 octane gasoline (Petroil Gasolina Premium). For this study, 6 kg of soil contaminated with 50 mL, 150 mL, and 300 mL of 90 octane gasoline was used, along with four treatments X1 ( Penicillium , Geotrichum , and, Rhizopus ), X2 ( Aspergillus , and, Penicillium ), X3 ( Penicillium , and, Geotrichum ) and X4 ( Penicillium ), said fungi were isolated from the fruit Citrus x sinensis (L.) Osbeck, 1765, and grown on wheat, rice, CPD, and Wheat + Penicillium media respectively. 500 mg of each consortium was inoculated to the treatments and then 250 g of already inoculated contaminated soil was dispersed to form the specimens. At 25 days after inoculation, the f nal quantity of hydrocarbons in the collected soil was established, determining that the four treatments act as bioremediators, with the average bioremediation of treatment X1 being 43.61%, X2 34.65%, X3 57.23% and X4 55.71%; treatment X3 being the most ef ective, but X4M3 had the highest percentage of all treatments with 72.06%. T us, it was concluded that treatment with f lamentous fungi Citrus x sinensis does have a bioremedial action in soils contaminated with gasoline. Keywords : Bioremediation – contaminated soil – cons ortium of f lamentous fungi 1 Laboratorio de Microbiología. Empresa NINDECYT. Lima, Perú. * Corresponding author: nindecyt@gmail.com / acanepa2@gmail.com Angela Cánepa-Carbajal: https://orcid.org/0000-0003-1165-1637Camila de la Cruz-Leytón: https://orcid.org/0000-0003-4955-0639César Lozano-Lévano: https://orcid.org/0000-0002-5275-538X
172 Cánepa-Carbajal et al. Te Biologist (Lima). Vol. 22, Nº2, jul - dec 2024 RESUMEN La contaminación por hidrocarburos es una de las principales causas de la infertilidad de áreas, dejando niveles muy críticos para el ecosistema, llegando a considerarse como uno de los problemas más concurrentes por el incontrolado manejo de estos de parte del sector industrial y productivo. Es por ello que se han formulado nuevas estrategias como una alternativa más confable en situaciones de respuesta a derrames de hidrocarburos, siendo la biorremediación con hongos y bacterias la estrategia más efciente. Es por ello por lo que en este estudio tuvo como objetivo determinar el efecto biorremediador de los hongos flamentosos ( Aspergillus, Penicillium, Geotrichum, y, Rhizopus ) en el suelo contaminado con Gasolina de 90 octanos (Petroil Gasolina Premiun). Para este estudio se usó 6 kg de suelo contaminado con 50 mL, 150 mL y 300 mL de gasolina de 90 octanos, junto con cuatro tratamientos X1 ( Penicillium, Geotrichum y, , Rhizopus ), X2 ( Aspergillus , Penicillium ), X3 ( Penicillium , y, Geotrichum ) y X4 ( Penicillium ), dichos hongos fueron aislados de la fruta Citrus x sinensis (L.) Osbeck, 1765 y cultivados en medio de trigo, arroz, CPD y Trigo + Penicillium respectivamente. Se inocularon 500 mg de cada consorcio a los tratamientos y luego se dispersó 250 g de suelo contaminado ya inoculado formando los ejemplares. A los 25 días de inoculado, se estableció la cantidad de hidrocarburos fnales del suelo recolectado, determinando que los cuatro tratamientos actúan como biorremediadores, siendo el promedio de biorremediación del tratamiento X1 con 43,61%, el X2 con 34,65%, el X3 con 57,23% y el X4 con 55,71%; siendo el tratamiento X3 el más efcaz, pero el X4M3 tuvo el mayor porcentaje de todos los tratamientos con 72.06%. Concluyendo así, que el tratamiento con los hongos flamentosos de Citrus x sinensis si presenta una acción biorremediadora en suelos contaminados con gasolina. Palabras clave: Biorremediación – suelo contaminado – consorcio de hongos flamentosos INTRODUCCIÓN En la actualidad, el mal manejo de los hidrocarburos y pesticidas artifciales de parte del sector industrial y productivo llegan a perjudicar de manera prolongada el ambiente y su entorno (Fernández, 2018; Rodríguez et al ., 2019; Rodríguez & Rodríguez, 2020; Tiodar et al ., 2021; Melo, 2022), llevando al empobrecimiento de las zonas aledañas, generando secuelas de manera continua en el sector productivo, para que fnalmente produzcan acumulaciones mayores originando variaciones en la temperatura, humedad y pH disminuyendo la riqueza de la zona agrícola, causando la infertilidad del suelo (Cerna-Apaza, 2018; Rico-Cerda et al ., 2020). Algunos métodos de remediación, como la incineración, han sido seriamente cuestionadas, debido a que, puede llegar a producir un efecto negativo en los cultivos y resurgimiento de la fertilidad del suelo; es por ello por lo que, algunos países han considerado nuevas estrategias de remediación utilizando organismos (Arao et al ., 2010; Nwankwegu & Onwosi, 2017).A nivel del Perú aún no se han considerado la biorremediación, como principal alternativa, pero algunos científcos han elaborado proyectos con diferentes biotecnologías para mejorar y recuperar las áreas contaminadas por estas sustancias toxicas mencionadas anteriormente, como el uso de la remediación por atenuación natural mejorada y la bioestimulación añadiendo nutrientes o aceptor de electrones (Fernández, 2018). Los hongos flamentosos contribuyen a la degradación de la materia orgánica por mecanismos bioquímicos y fsiológicos, permitiéndose absorber hidrocarburos y componentes esenciales por medio de sus micelios, los cuales pueden ser utilizados para procedimientos biotecnológicos con propósitos ambientales y agrícolas (Alonso, 2012; Alberti et al ., 2017; Manna et al ., 2020; Oshiquiri et al ., 2020; Sun et al ., 2020; Adjedje et al ., 2021; Delsarte et al., 2021; Anzueto et al ., 2024).La extracción de los hongos flamentosos de una fruta como Citrus se da por medio de la colecta de los frutos en estado de pudrición, las lesiones mostradas se raspan con una cuchilla para luego sembrarla en Agar Sabouraud-glucosa con cloranfenicol o estreptomicina y penicilina. Se incuban a 28°C por 15 dias y se obtiene las colonias de los hongos aislados, los cuales se identifcan por medio de su macro y micro morfología. Los hongos aislados son cultivados en Agar papa dextrosa para inducir a la esporulación y observar el crecimiento de los hongos (Aguirre-Carvajal & Proaño-Tuma, 2020).
173 Bioremediation of gasoline-contaminated soil with orange flamental fungi Te Biologist (Lima). Vol. 22, Nº2, jul - dec 2024 Es por ello por lo que el presente estudio evalúa el efecto biorremediador de los hongos flamentosos de Citrus x sinensis (L.) en el suelo agrícola contaminado con gasolina de 90 octanos. MATERIALES Y MÉTODOS El trabajo experimental se realizó en las instalaciones del laboratorio de Microbiología de la empresa NINDECYT, Lima, Perú en el periodo de junio a octubre del 2022. La población del estudio se consideró el suelo agrícola del Biohuerto “Productores” (11°58’50”S 77°4’46”W), en las cuales se extrajeron de forma aleatoria 6 kg de este suelo para ser evaluadas; la gasolina usada fue adquirida del Grifo PRIMAX (11°58’38”S 77°4’40”W). Las naranjas Citrus x sinensis fueron obtenidas del mercado “Productores” (11°58’50”S 77°4’46”W) en las que se seleccionaron aquellas en etapa de pudrición (10 unidades). Estos tres establecimientos se encuentran en el distrito de Los Olivos, Lima, Perú. Preparación de los medios de cultivoMedio de cultivo CPD (Caldo Papa Dextrosa) : Se hirvió tres papas amarillas sin cascara con 1L de agua potable. Luego, ½ L de agua de papa se fltró en un frasco de tapa rosca de 1L, y se agregó 10 g de dextrosa. Se autoclavó a 121°C por 20 min, luego al enfriar, se agregó 0,5 g de estreptomicina (Estreptomax), para evitar que el medio se contamine con bacterias (Vargas, 2012; Vargas et al ., 2017). Medio de Cultivo de semillas de trigo y arroz : Se seleccionó 125 g de semillas de trigo y 125 g de arroz, para posteriormente, enjuagar y dejar reposar 24 h. Luego se añadió 100 ml de H 2 O 2 para su desinfección. Se escurrió el grano durante 2 h, se distribuyeron en dos frascos de tapa rosca de 1L y posteriormente se esterilizó a 121°C durante 20 min (Canal SporeWorld, 2021). Medio de Cultivo de semillas de trigo y Penicillium : al medio de cultivo de semillas de trigo se le agregó 25 g de Penicillium aislado en medio Agar Sabouraud Dextrosa (SDA), para su proliferación. Sembrado e identifcación de los hongos Se seleccionó la parte de las naranjas que se encontraban en etapa de pudrición para realizar un licuado y formar un concentrado de hongos. Luego se agregó 25 mL de dicho concentrado a cada medio de cultivo y se incubó a 25 °C por 10 a 15 días, al 6 to y 12 vo día de incubación, y se agitaron los granos para que el micelio se disperse. La observación e identifcación de los hongos, se realizó mediante la técnica de observación directa y la técnica microscópica de la cinta adhesiva, colocando una gota de azul de lactofenol en un portaobjetos junto con 1cm 2 de cinta adhesiva con las esporas ya adheridas (Fernández, 2018), para luego utilizar el trabajo de Ochoa et al. (2007) como referencia en la identifcación taxonómica. Contaminación del sueloSelección y Recolecta del suelo agrícola . Se seleccionó la muestra del biohuerto del mercado Productores 11°58’50”S 77°4’46”W para la cual se extrajo 6 kg (1,75kg por tratamiento) los cuales se colectaron en bolsas de 1kg. Contaminación y Homogeneizado del suelo agrícola . Se compró gasolina comercial de 90 octanos y se distribuyó en tres diferentes concentraciones M1=50 mL, M2=150 mL y M3=300 mL rociando de manera uniforme a la muestra, y se homogenizó por siete días con ayuda de una varilla, hasta que pueda penetrar al suelo completamente (Cerna-Apaza, 2018; Fernández, 2018). Análisis de los parámetros fsicoquímicos pH y T° . Se utilizó un pHmetro digital (EZ-9901), para tomar la medida del pH y temperatura antes, durante y después de aplicar los tratamientos a cada repetición. Análisis Inicial de la Cantidad de Hidrocarburos en el Suelo Recolectado . Se utilizó el método de Soxhlet según la metodología adaptada de Pons-Jiménez et al. (2011) y Cerna-Apaza (2018). Después del análisis, se distribuyeron 250 mg del suelo ya contaminado a cada recipiente de plástico (24 en total – 9 por tratamiento), para facilitar la inoculación de los hongos (Fernández, 2018; Cerna-Apaza, 2018). Inoculación de los consorcios de hongos en las muestras La inoculación fue de manera directa, se distribuyó 500 mg de cada consorcio preparado a los tratamientos y luego se dispersó 250 g de suelo contaminado ya inoculado formando los ejemplares. A estos ejemplares se adicionó agua cada dos días para mantener las condiciones de humedad adecuadas para la biorremediación, adicionando la aireación del suelo después del respectivo riego. Evaluación del suelo contaminado A los 25 días de inoculado los consorcios, se determinó la cantidad de hidrocarburos fnales del suelo recolectado,
174 Cánepa-Carbajal et al. Te Biologist (Lima). Vol. 22, Nº2, jul - dec 2024 volviendo a realizar el método de Soxhlet, desarrollando el mismo proceso que se hizo en el análisis inicial. Análisis de Datos Los datos obtenidos se analizaron con el programa estadístico Microsoft Excel. Cada conjunto de datos en la experimentación se recolectó en dos repeticiones y el resultado fue la media de dos grupos de datos usando ANOVA. Mientras que las diferencias estadísticas al 5% de nivel de signifcación se analizaron con la prueba de comparación múltiple de Tukey. Aspectos éticos En la elaboración del proyecto se utilizaron citas y referencias verídicas, además de que no hubo ninguna modifcación de los resultados obtenidos, por lo que ninguna información fue manipulada acorde al desarrollo del trabajo de investigación, se siguió correctamente los protocolos para el manejo de hidrocarburos y muestras contaminadas con ellos, asi mismo, para la preparación de los medios de cultivo. RESULTADOS Y DISCUSIÓNIdentifcación de los Hongos Filamentosos de Citrus x sinensis Se identifcaron cuatro géneros en total: Geotrichum , Penicillium , Rhizopus y Aspergillus . Tabla 1. Género de hongos encontrados en los cuatro tipos de medios utilizados. MEDIOS UTILIZADOSHONGOS AISLADOSX1 Cultivo de granos de Triticum sp. GeotrichumPenicilliumRhizopus X2 Cultivo de granos de Oriza sativaAspergillusPenicillium X3 Caldo papa dextrosa (CPD) PenicilliumGeotrichum X4 Cultivo de granos de Triticum sp. + 25 g de Penicillium sp. aislado Penicillium Estos resultados concuerdan con Contreras & Carreño (2018), quienes identifcaron hongos flamentosos de suelos contaminados por hidrocarburo (petróleo) utilizando el agar Bushnell Haas–petróleo 1%, aislando 14 géneros, entre ellos Penicillium sp. y Aspergillus sp., siendo descritos como hongos hidrocarbonoclasticos. Ochoa et al . (2007) aislaron tres hongos de Citrus x sinensis utilizando el medio agar PDA, de los géneros Aspergillius , Penicillium y Fusarium . En contrastación con los resultados, Huamán & Montalvo-Valencia (2019) identifcaron dos géneros diferentes de hongos de Citrus x sinensis : Rhizoctonia sp. y Fusarium sp., aislaron estos hongos utilizando, como en este estudio, el agar PDA. De la misma manera, Cárdenas et al. (2022) identifcaron hongos asociados a Citrus x sinensis , utilizando el agar PDA, aislando únicamente a Trichoderma sp. Medida de Parámetros Fisicoquímicos (pH y T°) Analizando los resultados se puede observar que el pH antes de la biorremediación era más neutro (7,1-7,3) a comparación del pH fnal (7,5-7,7), obteniendo una variación de mínima entre la primera repetición con la segunda repetición; mientras que la temperatura no varía en cada repetición manteniendo 19,5°.De acuerdo con esto, Campian (2018) que evaluó a Penicillium en la reducción de aceite dieléctrico en suelo, encontró que al fnal de los tratamientos el pH quedaba entre 7-7,18, mientras que la temperatura oscilaba entre 20,70° - 20,90°; ambos valores, tanto del pH como de la temperatura, permiten al suelo volver a tener la capacidad de cultivo; por lo que, los resultados son similares a nuestros resultados.
175 Bioremediation of gasoline-contaminated soil with orange flamental fungi Te Biologist (Lima). Vol. 22, Nº2, jul - dec 2024 Análisis de la biorremediación de los hidrocarburos en el suelo agrícola En la Tabla 2 se muestra el porcentaje de biorremediación con los 4 tratamientos (X1, X2, X3, y X4) sobre las tres muestras problemas (M1=50 ml, M2=150 mL y M3=300 mL de gasolina); utilizando la siguiente fórmula: Tabla 2. Porcentaje y promedio de remediación de los 4 tratamientos X1, X2, X3, y X4 aplicados a la muestra de suelo contaminado con gasolina 90 octanos. Tratamientos% Biorremediación% Promedio de biorremediación X1M139,8843,61X1M230,21X1M360,73X2M125,0034,65X2M225,52X2M353,44X3M160,1257,23X3M249,22X3M362,35X4M141,6755,71X4M253,39X4M372,06 El porcentaje de mayor promedio de biorremediación fue el tratamiento X3 con Penicillium y Geotrichum para las tres muestras problema. Solo para M1, el porcentaje de biorremediación más elevado se obtuvo con el tratamiento X3 con 60,12%; así mismo para M2 y el M3 fue con el tratamiento X4 con Penicillium con 53,39% y 72,06%, respectivamente. Se evaluó el análisis de varianza de un solo factor teniendo un F calculado de 34,281 con un F critico de 2,816, encontrando así diferencias signifcativas entre tratamientos. Habiendo así una diferencia signifcativa de las medias entre los cuatro tratamientos, siendo el del tratamiento X4 de Penicillium spp. aislado, el de mayor porcentaje biorremediación. Tabla 3. Valores de la prueba Tukey para los cuatro tratamientos aplicados. HSD Tukey a CONSORCIO NSubconjunto para alfa = 0,051X430,1383X330,1493X130,1876X230,214Sig.0,588 % 퐵퐵퐵퐵퐵퐵퐵퐵퐵퐵퐵퐵퐵퐵퐵 = 퐻퐵퐵퐵퐵퐵퐵퐵퐻퐻퐵퐵퐻 푡퐵푡퐵푡퐵퐻 푚푚푚푚푚푚푚 퐻퐵퐵퐵퐵퐵퐵퐵퐻퐻퐵퐵퐻 푡퐵푡퐵푡퐵퐻 푚푚푟푚푚푟푟푟 ó 퐻퐵퐵퐵퐵퐵퐵퐵퐻퐻퐵퐵퐻 푡퐵푡퐵푡퐵퐻 푚푚푚푚푚푚푚
176 Cánepa-Carbajal et al. Te Biologist (Lima). Vol. 22, Nº2, jul - dec 2024 De acuerdo con nuestros resultados, Cerna-Apaza (2018) trató suelo con dosis elevadas de hidrocarburos, con tres dosis (10%, 20% y 40%) de una especie de Penicillium , siendo este hongo encontrado en los cuatro tratamientos planteados en este trabajo; al igual que Campian (2018) en el que aplico tres tratamientos (10%, 20% y 30%) de Penicillium en suelo contaminado con aceite dieléctrico. En ambos trabajos, Penicillium cumple con la función de biorremediación, en ambos tratamientos, siendo 40% y 30% los de mejor efcacia. También, Contreras & Carreño (2018) evaluó suelos contaminados con petróleo, utilizando 10 tipos de hongos considerados hidrocarboloclasticos, entre ellos Aspergillus (encontrado en el tratamiento X2), Penicillium (encontrado en todos los tratamientos) y Rhizopus (encontrado en el tratamiento X1), fueron los que brindaron la mayor efcacia de biorremediación, con 52%, 27% y 13% de biorremediación, respectivamente; en el que Aspergillus alcanzo el 73% de eliminación de petróleo. Por lo mismo, se concluye que los cuatro géneros de hongos aislados en el presente trabajo, tiene la característica de ser hidrocarbonoclásticos, lo que les da la característica de subsistir con hidrocarburos como su fuente de energía facilitando la mineralización de estos a través de compuestos orgánicos de enlaces fáciles de romper (Madsen, 1991), debido a su efcacia en la reducción de hidrocarburos como la gasolina. De estos hongos, el género Penicillium apareció en los cuatro tratamientos, pero el tratamiento X3 tuvo un promedio de biorremediación de 57,23%, aun así, el X4 en la muestra M3 el porcentaje mayor de 72,06%. Author contributions: CRediT (Contributor Roles Taxonomy)ACC = Angela Cánepa-Carbajal CDL = Camila de la Cruz-Leyton CLL = César Lozano-Lévano Conceptualization : ACC, CDL Data curation : CDL Formal Analysis : ACC, CDL Funding acquisition : ACC, CLL Investigation : ACC, CDL Methodology : ACC, CDL Project administration : CDL, CLL Resources : CLL Software : CLL, ACC, CDL Supervision : CLL, CDL Validation : CDL, CLL Visualization : CDL, CLL Writing – original draft : ACC Writing – review & editing : CDL REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Adjedje, V. K., Schell, E., Wolf, Y. L., Laub, A., Weissenborn, M. J., & Binder, W. H. (2021). Enzymatic degradation of synthetic polyisoprenes via surfactant-free polymer emulsifcation. Green Chemistry, 23 , 9433-9438. Aguirre-Carvajal, K. E., & Proaño-Tuma, K. I. (2020). Evaluación de la actividad antifúngica de los aceites esenciales de Clinopodium tomentosum (Kunth) Govaerts., Tagetes minuta L., y Minthostachys mollis (Kunth) Griseb., para el control in vitro de Aspergillus niger y Fusarium oxysporum (Trabajo de titulación, previo a la obtención del Título de Ingeniero en Biotecnología, Universidad de las Fuerzas Armadas). https://repositoriobe.espe.edu.ec/server/api/core/bitstreams/1ad53665-c3da-488d-8e8f-b9adabc73a0f/contentAlberti, F., Foster, GD, & Bailey, AM (2017). Productos naturales a partir de hongos flamentosos y producción por expresión heteróloga. Applied Microbiology and Biotechnology, 101 , 493-500. Alonso, R. (2012). Proyecto de recuperación de suelos contaminados por hidrocarburos. (Proyecto fnal de carrera para optar el título Ingeniera técnica industrial). Universidad Autónoma de Barcelona.Anzueto, B. I. G., Ravelo, S. G. M., Mendoza, D. G., Zepeda, F. R., & Mejía, M. R. (2024). Reporte taxonómico de hongos flamentosos presentes en lodo residual de depuradora con potencial biotecnológico. Revista Colombiana de Investigaciones Agroindustriales , 11 , 42-56.Arao, T., Ishikawa, S., Murakami, M., Abe, K., Maejima, Y., & Makino, T. (2010). Contaminación por metales pesados del suelo agrícola y contramedidas en Japón. Paddy and water Environment, 8 , 247-257. Campian, D. (2018). Reducción de aceite dieléctrico en el suelo contaminado utilizando las cepas de
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