The Biologist
(Lima)
ISSN Versión Impresa 1816-0719
ISSN Versión en linea 1994-9073 ISSN Versión CD ROM 1994-9081
ORIGINAL ARTICLE /ARTÍCULO ORIGINAL
CHROMOSOMES, DNA LESION AND NUCLEAR MALFORMATION IN THE
FRESHWATER TURTLE KINOSTERNON LEUCOSTOMUM (TESTUDINES:
KINOSTERNIDAE)
CROMOSOMAS, LESIÓN DEL ADN Y MALFORMACIÓN NUCLEAR EN LA
TORTUGA DULCEACUÍCOLA KINOSTERNON LEUCOSTOMUM (TESTUDINES:
KINOSTERNIDAE)
1Instituto Tecnológico Superior de Comalcalco, carretera vecinal Comalcalco-Paraíso Km 2.0, Ra. Occidente 3ra. Sección,
C.P. 86650. Comalcalco, Tabasco, México. Correo electrónico: jhernandez-guzman@hotmail.com
2Universidad Politécnica del Centro, carretera federal Villahermosa-Teapa Km 22.5, Tumbulushal, C.P. 86290, Centro,
Tabasco, México.
The Biologist (Lima), 13(2), jul-dec: 201-211.
201
ABSTRACT
Key words: cells, chromosome, Kinosternon leucostomum, micronucleus, turtle.
Kinosternon leucostomum is one of the common freshwater turtles in Tabasco State, Mexico.
However, studies of this species are limited for this region. The pollution in aquatic ecosystems
from Tabasco is increasing and the effects on wildlife have not been properly made. Therefore, a
chromosomic study and DNA lesion and nuclear malformation was performed in K.
leucostomum from Tabasco. The karyotype in the turtle K. leucostomum is 34 msm/A + 22 T/C
(2n=56 chromosomes). Also, intracellular malformations were identified: Chromosomes and
DNA damage (micronucleus), binucleated cells, trinucleated cells, tetranucleated cells, cells in
apoptosis and nucleoplasmic bridge, in irregular proportions. The probable origin of cell
disorders is due to the presence of contaminants in aquatic ecosystems from Tabasco.
1 1 1 1
Javier Hernández-Guzmán ; Alfredo Arias Trinidad ; Raúl E. Islas-Jesús ; Azucena Fraire-Vázquez ;
1 2 1
R. Isela De la cruz-Izquierdo ; Nancy C. García-Guzmán & Xiutlhalzin Ruiz
RESUMEN
Palabras clave: células, cromosoma, Kinosternon leucostomum, micronúcleos, tortuga.
La especie Kinosternon leucostomum, es una de las tortugas dulceacuícolas comunes del estado
de Tabasco, México. Sin embargo, los estudios en esta especie son escasos para esta región. La
contaminación en los ecosistemas acuáticos de Tabasco están aumentando cada vez más, y los
efectos a la fauna silvestre no se han realizado adecuadamente. Por ello, se realizó un estudio
cromosómico, de lesión de ADN y malformación nuclear en la especie K. leucostomum de
Tabasco. El cariotipo en la tortuga K. leucostomum fue 34 msm/A + 22 T/C (2n=56 cromosomas).
También, se identificaron malformaciones intracelulares: lesión del ADN y cromosomas
(micronúcleos), células binucleadas, células trinucleadas, células tetranucleadas, células en
apoptosis y puentes nucleoplásmicos, en proporciones irregulares. El origen probable de las
alteraciones celulares es debido a la presencia de contaminantes en los ecosistemas acuáticos de
Tabasco.
The Biologist (Lima). Vol. 13, Nº2, jul-dec 2015
202
oxidación e inhibición de proteínas esenciales
por la interacción con sus grupos tioles, y
posteriormente alterar los procesos
metabólicos en el citosol, por lo que después de
la exposición a estos contaminantes, la
morfología interna y externa de la célula puede
cambiar (Meharg 1993, Hernández & Cooke
1997, Banfalvi 2011).
Por otro lado, los análisis citogenéticos en la
región aún son insuficientes con relación a la
biodiversidad que alberga, mientras que los
estudios de micronúcleos y alteraciones
celulares no tienen precedentes (Hernández-
Guzmán et al. 2014, Hernández-Guzmán &
Islas-Jesús 2014). Esto, ha despertado el
interés de investigaciones en el estado de
Tabasco, México, ya que el número de
alteración o modificación en la sanidad del
ambiente y de la biodiversidad ha sido
perturbado por los contaminantes presentes en
los diversos ecosistemas (Díaz-González et al.
1994, Ramos-Herrera et al. 2012).
Por lo anterior, el presente estudio fue
realizado con la finalidad de identificar
cromosomas, lesión del ADN y malformación
nuclear a través del cariotipo en la tortuga
dulceacuícola Kinosternon leucostomum
(Duméril, Bibron & Duméril 1851). Esta
especie se distribuye en todo el estado de
Tabasco, México y es considerada como una
de las tortugas dulceacuícolas de mayor
importancia cultural y gastronómica para el
estado de Tabasco.
Área de colecta
Se recolectaron seis especímenes de la tortuga
dulceacuícola K. leucostomum en dos
ecosistemas acuáticos; tres (una hembra y dos
machos) en el río Seco con coordenadas
18°15´57.57´´ N y 93°13´16.40´´ O y tres
hembras de una laguna permanente con
En el estado de Tabasco, sur de México, así
como en el norte de México, se han realizado
diversas investigaciones en la que se ha
comprobado la existencia de modificación de
la interacción ecológica por actividades
antropogénicas y contaminantes tóxicos
(García-Gutiérrez & Rodríguez-Meza 2012,
Hernández-Acosta et al. 2013, Pérez et al.
2013) así como estudios que demuestran la
alteración genética a través de los análisis de
los cromosomas, presentándose ocurrencias de
anfibios triploides (Hernández-Guzmán
2009), diferenciación cariomórfica de peces
(Arias-Rodríguez et al. 2008, Bucio-Luna
2015), anfibios y reptiles (Hernández-Guzmán
et al. 2011, Hernández-Guzmán et al. 2014,
Hernández-Guzmán & Islas Jesús, 2014) solo
en la región del sureste mexicano.
La existencia de contaminantes tóxicos en los
ecosistemas acuáticos en el estado de Tabasco
es innegable, existiendo pruebas de tal hecho
desde 1983 y más reciente en la fauna silvestre
nativa (Rosas et al. 1983). La acción negativa
de los metales pesados divalentes sobre el
metabolismo es ocasionada al menos por dos
vías, transporte medio-ambiente disperso en el
aire, agua, polvo y alimento; la segunda, por
alterar la forma bioquímica de los elementos.
La habilidad de la vida silvestre para acumular
y concentrar metales pesados tales como el
cadmio y otros metales divalentes,
incrementan el riesgo de toxicidad sobre la
cadena alimenticia, siendo la dieta una de las
principales vías de exposición a metales
(Nava-Ruíz & Méndez-Armenta 2011).
H i p o t é t i c a m e n t e s e c r e e q u e l a s
malformaciones intracelulares se inician en la
membrana plasmática, ya que es considerada
como la primera estructura viva que es
afectada por la toxicidad de los metales. El
daño en las membranas por los metales, puede
consistir en cambios en la composición y
estabilidad de los lípidos de la membrana,
INTRODUCCIÓN
Hernández-Guzmán et al.
MATERIALES Y MÉTODOS
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Chromosomes in turtle Kinosternon leucostomum
coordenadas 18°17´01.95´´ N y 93°13´00.29´´
O, en el municipio de Comalcalco, Estado de
Tabasco, México, los cuales fueron
trasladados a laboratorio para realizar el
procedimiento citogenético y método squash
para la observación de los cromosomas,
núcleos y micronúcleos.
Técnica citogenética y squash
Se efectuó una biopsia abierta a los
especímenes para extraer muestras de sangre y
tejido de órganos blancos (riñón y páncreas),
con los cuales se prepararon squash (frotis de
tejido hematopoyético) y los órganos blancos
fueron disgregados en tubos de ensayo de 14
mL que contenían 5 mL de solución hipotónica
al 1,0%, dejando a exposición durante 10 min;
posteriormente se agregó 2 mL de fijador en
proporción 4:1 (metanol, ácido acético)
haciendo tres recambios de fijador,
centrifugando las muestras a 7000 rpm durante
10 min; seguidamente, se extrajo 1,5 mL del
tejido disgregado y previamente fijado en
microtubos de 2,0 mL. Después, se gotearon
42 muestras de tejido hematopoyético y tejido
blanco (21:21 respectivamente) y se tiñeron
con colorante biológico Giemsa al 10% en
buffer de fosfatos con pH de 7,0 (Kligerman &
Bloom 1977). El procedimiento fue basado en
modificaciones a la técnica citogenética de
Hernández-Guzmán et al. (2014) para tortugas
y empleando los parámetros citogenéticos para
la clasificación cromosómica de Levan et al.
(1964) y Bickham (1975).
Análisis microscópico
La búsqueda de las dispersiones se realizaron
con objetivos de 40X y se tomaron fotografías
con cámara digital utilizando el objetivo de
100X. Posteriormente se empleó el software
MicroMeasure 3.3 (Reeves 2001), para hacer
las medidas en µm de los cromosomas, núcleos
y micronúcleos.
Procedimiento estadístico
Se llevó a cabo un análisis multivariado: Para
el cual se utilizó la propuesta elaborada por
Sokal & Sneath (1963) citado en Franco-Navia
et al. (2010), que consistió en la elaboración de
una Matriz de similitud con medidas
euclidianas y un análisis clúster para la
medición de distancias citogenéticas con otros
estudios en tortugas realizado con el software
PAST 2.01 (Hammer et al. 2001), con la
finalidad de obtener la comparación
cariomórfica con especies de la subfamilia
Kinosterninae. Además, se realizó un análisis
de varianza de una vía con la prueba de Tukey
(p=0,05) para el análisis del nivel de
significancia de los datos obtenidos entre
complementos cromosómicos.
El conteo de micronúcleos en eritrocitos fue
expresado en porcentaje y utilizando los
criterios de Prieto et al. (2008) para
organismos acuáticos:
Donde ncMn = número de células con
micronúcleo, N=número total de células
analizadas.
S e a n a l i z a r o n 2 5 6 pr e p a r a c i o n e s
cromosómicas de las 46 muestras elaboradas,
de las cuales el 68% correspondió a células con
2n=56 cromosomas, mientras que el restante
32% se dispersaron en números cromosómicos
debajo y encima de los 56 cromosomas
caracterizados para K. leucostomum. El
tamaño de los cromosomas de la tortuga
pochitoque, presentaron sus primeros pares de
tipo birrámeo, 2,48±0,26 µm de brazo corto y
3,85±0,29 µm de brazo largo, mientras que en
sus últimos pares cromosómicos presentaron
0,89±0,16 µm de brazo corto y 2,22±0,22 µm
de brazo largo; por otro lado, las medidas de los
cromosomas tipo monorrámeo en sus primeros
pares correspondieron a 3,36±0,15 µm y en sus
últimos pares cromosómicos a 1,63±0,12 µm.
La clasificación cromosómica de acuerdo con
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Mnc= ncMn
Nx 100
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Hernández-Guzmán et al.
Levan et al. (1964) fue 34 msm + 22 T,
mientras que la clasificación de acuerdo con
Bickham (1975) fue 34 A + 22 C (Tabla 1,
Figura 1).
De las 126 muestras preparadas por el método
de squash con tejido y sangre periférica de K.
leucostomum, se identificó que los
especímenes de Río seco, presentaron
anormalidades celulares, de las cuales, 113
células (15%) obtuvieron la presencia de
micronúcleos, de los cuales 92 células (11%
del total analizadas) presentaron un
micronúcleo en su estructura intracelular,
mientras que 16 células (2% del total
analizadas) presentaron dos micronúcleos en
su estructura intracelular y cinco células (1%
del total analizadas) presentaron tres
micronúcleos en su estructura interna.
Además, 15 células se caracterizaron por la
presencia de binúcleos (2% del total de células
analizadas), mientras que el resto de las células
(696=84%) de 824 contabilizadas, se
consideraron morfológicamente sanas.
También, fue posible identificar la presencia
de puentes nucleoplásmicos a nivel nuclear y a
nivel micronuclear, alteraciones totales al
ADN que se manifestaron en núcleos y
cromosomas fragmentados, parcial o
totalmente destruidos, aunado con las
porciones de ADN con morfología de
micronúcleo (Figura 2).
En el estudio citogenético de K. leucostomum
de los ecosistemas acuáticos de Comalcalco,
Tabasco, México se ratificó el número modal
en condición diploide 2n=56 cromosomas, el
cual había sido descrito por Hernández-
Guzmán et al. (2014), para organismos de
municipios de Cárdenas y Centro (Tabasco,
México). A pesar de que las poblaciones de
tortugas de la especie K. leucostomum son
geográficamente cercanas, los especímenes de
Comalcalco presentaron variación en la
morfología de los cromosomas, los cuales se
evidencian en el número de cromosomas tipo
metacéntrico-submetacéntrico “msm”, 34 en
especímenes de Comalcalco y 12 en
especímenes de Cárdenas y Centro; estas
variaciones también se reflejan en el número
de cromosomas tipo subtelocéntrico-
telocéntrico “stt”, los cuales son inexistentes
en los especímenes de K. leucostomum de
Comalcalco, mientras que en los especímenes
de Cárdenas y Centro se identifican 22
cromosomas. La similitud entre estas
poblaciones, se restringe desde el punto de
vista citogenético, en los cromosomas tipo
Telocéntrico “T” ya que en todas las
poblaciones de K. leucostomum se identifican
22 cromosomas tipo “T”. El estudio previo de
Hernández-Guzmán et al. (2014) en la especie
K. leucostomum, es el único antecedente con el
cual se puede llevar a cabo una comparación
citogenética de acuerdo con los parámetros de
Levan et al. (1964) directamente con la especie
con distribución en Tabasco, México, ya que
por la complejidad de la investigación
cromosómica en las tortugas y debido a que los
organismos presentan cromosomas difíciles de
observar y de medir, las investigaciones
previas en estos reptiles clasifican a los
cromosomas a través de los parámetros de
Bickham (1975), el cual es una clasificación
más generalista. De acuerdo con estos
parámetros, la clasificación cromosómica de
K. leucostomum de Comalcalco corresponde a
34 A + 22 C y los especímenes de Cárdenas y
Centro con 12 A + 22 B + 22 C. El análisis de
varianza de una vía entre los cromosomas de K.
leucostomum de origen de Comalcalco,
Tabasco, México con los de origen de
Cárdenas y Centro, Tabasco, México, no
presentaron diferencias significativas con la
prueba de Tukey (p=0,05). En otro contexto, la
comparación del presente estudio con otras
investigaciones en especies de la subfamilia
Kinosterninae, la tortuga K. leucostomum
presenta el mismo número de cromosomas
diploides 2n=56, compartiendo esta
característica con K. l. postinguinale (Cope
1887) de acuerdo con Killebrew (1975), K.
flavescens (Agassiz 1857) de acuerdo con
Stock (1972) & Killebrew (1975), K.
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Chromosomes in turtle Kinosternon leucostomum
subrubrum (Bonnaterre 1789) de acuerdo con
Stock (1972) & Gorman (1973), K. s.
hippocrepis (Gray 1855) de acuerdo con
Killebrew (1975), K. s. steindachneri
(Siebenrock 1906) según Killebrew (1975) &
Sites et al. (1979), K. hirtipes (Stejneger 1925)
de acuerdo con Killebrew (1975), sin embargo,
existen reportes aislados en la que especies de
este grupo de tortugas presentan 2n=54
cromosomas como en K. subrubrum (Forbes
1966) y 2n=50 cromosomas en Sternotherus
odoratus (Latreille 1801) en acuerdo con
Risley (1936); no obstante, la estadística de
estos primeros registros pueden atribuirse a la
técnica de la época y a la información
inexistente en este grupo de tortugas. De
acuerdo con el análisis clúster citogenético de
las especies que se ubican en el grupo
Kinosterninae, se describen tres grupos
principales: grupo A, caracterizado por
especies que presentan nivel diploide de 2n=56
cromosomas con 1n=28 cromosomas; el grupo
N= par cromosómico, r= proporción de brazos (r=q/p), i= índice centromérico (i=
(100*p)/(p+q)), d= diferencia entre brazos (d= (r-1)*10/(r+1)).
Tabla 1. Medidas en micrómetros de los cromosomas de Kinosternon leucostomum con 2n=56 cromosomas.
Brazo largo
Brazo
Corto r i d Clasificación
29 2,48±0,26 1,55 39,16 2,17 msm/A
10 1,96±0,19 1,68 37,28 2,54 msm/A
26 1,85±0,19 1,48 40,30 1,94 msm/A
17 1,71±0,21 1,81 35,58 2,88 msm/A
18 1,64±0,24 1,73 36,58 2,68 msm/A
50 1,59±0,24 1,89 34,59 3,08 msm/A
14 1,49±0,28 2,05 32,77 3,45 msm/A
29 1,41±0,28 2,15 31,75 3,65 msm/A
34 1,38±0,26 2,18 31,45 3,71 msm/A
39 1,32±0,29 2,08 32,50 3,50 msm/A
17 1,26±0,33 2,14 31,86 3,63 msm/A
09 1,22±0,30 2,14 31,82 3,64 msm/A
34 1,16±0,28 2,46 28,86 4,23 msm/A
13 1,11±0,28 2,21 31,14 3,77 msm/A
03 1,05±0,27 2,14 31,80 3,64 msm/A
16 0,97±0,23 2,45 28,96 4,21 msm/A
22 0,89±0,16 2,50 28,54 4,29 msm/A
15 0,00 - 0,00 10,00 T/C
07 0,00 - 0,00 10,00 T/C
07 0,00 - 0,00 10,00 T/C
13 0,00 - 0,00 10,00 T/C
17 0,00 - 0,00 10,00 T/C
08 0,00 - 0,00 10,00 T/C
01 0,00 - 0,00 10,00 T/C
03 0,00 - 0,00 10,00 T/C
06 0,00 - 0,00 10,00 T/C
12 0,00 - 0,00 10,00 T/C
12 0,00 - 0,00 10,00 T/C
N
1 3,85±0,
2 3,30±0,
3 2,75±0,
4 3,09±0,
5 2,85±0,
6 3,00±0,
7 3,06±0,
8 3,04±0,
9 3,02±0,
10 2,75±0,
11 2,70±0,
12 2,62±0,
13 2,85±0,
14 2,46±0,
15 2,25±0,
16 2,38±0,
17 2,22±0,
18 3,36±0,
19 2,98±0,
20 2,86±0,
21 2,77±0,
22 2,61±0,
23 2,46±0,
24 2,30±0,
25 2,23±0,
26 2,13±0,
27 1,86±0,
28 1,63±0,
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206
Hernández-Guzmán et al.
B, con nivel diploide de 2n=54 cromosomas y
1n=27; el grupo C, con nivel diploide de 2n=50
cromosomas y 1n=25 (Figura 3).
Por otro lado, el daño del ADN que se
manifiesta por la presencia de micronúcleos
espontáneos, morfología atípica de los
cromosomas y núcleos con distintos grados de
fragmentación puede tener diferentes
orígenes, desde material particulado en
suspensión (PM10), es decir, por
contaminación atmosférica de acuerdo con
Anze et al. (2007) y García-Ferreyra &
Carreras-Arancibia (2008), por presencia de
metales pesados como el cromo VI (Prieto et
al. 2008) y otros metales divalentes como el Cd
y Pb (Sabath & Robles-Osorio 2012), por
herbicidas como el glifosato de acuerdo con
Mañas-Torres et al. (2006), por hidrocarburos
policíclicos aromáticos (HPA) como el
fenantreno, Corredor-Santamaría et al. (2012)
o por actividades antropogénicas en zonas
A
B
C
D
E
Figura 1. Cariotipo de Kinosternon leucostomum 2n=56 (A), dispersiones cromosómicas de organismos hembras (B y C),
dispersiones cromosómicas de organismos machos (D y E).
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Chromosomes in turtle Kinosternon leucostomum
urbanas (Sotil et al. 2007, Pollo et al. 2012,
Carraffa et al. 2013); por lo tanto, los causantes
de las malformaciones intracelulares en K.
leucostomum de Comalcalco, Tabasco,
México podría deberse a diversos agentes
genotóxicos y no solo a uno, esto
considerando, que el municipio de Comalcalco
y el estado de Tabasco son productores y
exportadores de hidrocarburos y de que existen
registros de la presencia de metales pesados en
los ecosistemas acuáticos y en fauna silvestre
de la capital del estado (Villahermosa,
Tabasco) de acuerdo con Rosas et al. (1983) y
Gamboa et al. (2009). Por otro lado, el registro
de anomalías intracelulares en K. leucostomum
del presente documento se suma a la
investigación de Hernández-Guzmán et al.
(2014) en la misma especie, donde se
d e s c u b r i e r o n l a p r e s e n c i a d e
microcromosomas “B”.
A B
CD
EF
Figura 2. Alteraciones intracelulares en Kinosternon leucostomum. Célula binucleada (A), núcleo con puente nucleoplásmico
(B), micronúcleo con puente nucleoplásmico (C), micronúcleo (D, E), lesión total del ADN nuclear (F).
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208
Hernández-Guzmán et al.
En conclusión, se determinó que especímenes
de la tortuga K. leucostomum de Comalcalco
Tabasco, México presentaron diversas
anomalías intracelulares, los cuales, pueden
manifestar repercusiones en su progenie, así
mismo, la evidencia de modificación del
material genético desde el punto de vista
citogenético y citológico en dichos organismos
da cabida a hipotetizar que otras poblaciones o
especies pueden estar presentando las mismas
condiciones que K. leucostomum, por lo que se
recomienda extender los estudios en este
campo, así como estudios que confirmen el
agente genotóxico responsable de las
alteraciones celulares registradas.
Figura 3. Análisis clúster citogenético en especies del grupo Kinosterninae. Característica citogenética principal: 2n=54 (A),
2n=54 (B), 2n=50 (C).
A
B
C
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20
6.4
5.6
4.8
4
3.2
2.4
1.6
0.8
0
S_o_Risley
K_subru_Fo.
S_o_Forbes
S_minor
S_carinatus
S_o_Stock
K_bauri
K_s_cruent.
K__s abaxi.
K_s_caraja.
K_s_scorpio.
K_scorpio.
K_herrerai
K_integrum
K_hirtipes
K_s_steind.
K_s_hippo.
K_subru_St
K_flaves.
K_l_posting.
K_leucosto.
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