The Biologist
(Lima)
ISSN Versión Impresa 1816-0719
ISSN Versión en linea 1994-9073 ISSN Versión CD ROM 1994-9081
ORIGINAL ARTICLE /ARTÍCULO ORIGINAL
TRANSCRIPTION FACTORS OF EMBRYONIC STEM CELLS AND INDUCED
PLURIPOTENT STEM CELLS
FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS Y
CÉLULAS MADRE PLURIPOTENTES INDUCIDAS
1 2
Ruth Aquino Ordinola & Luis Tume
1 Laboratorio de Biología molecular, Facultad de Medicina Humana, Universidad Nacional de Tumbes, Perú.
2 Laboratorios de Investigación y Desarrollo, Facultad de Ciencias y Filosofía,
Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú.
Correo electrónico: luis.tume.f@upch.pe
, jan-jun: 143-152. The Biologist (Lima), 13(1)
ABSTRACT
Keyword: epigenetic, pluripotency, Stem cells, transcription factors.
Since their therapeutic potential was discovered, stem cells with pluripotent capacity have been
sought, and since then embryonic stem cells (ESCs) became an important center in stem cell-
based therapy, there are ethical problems with the use of embryos. Using a small group of
transcription factors (c-Myc, Oct4, Klf4 and Sox-2), fibroblasts in pluripotent stem cells (iPSC)
were converted. This stem cell technology currently has some disadvantages, because there are
differences in gene expression profiles due to retention of an "epigenetic memory" from the cells
from which they were derived; this could cause problems when applying them in therapy. In this
review we discuss the role of some transcription factors involved in iPSCs and ESCs.
143
En las células madre desde que se descubrió su potencial terapéutico se han buscado células
madre con capacidad pluripotente, y desde entonces las células madre embrionarias (ESCs) se
convirtieron en un centro importante en la terapia celular basada en células madre, ya que a partir
de éstas se forman todos los tejidos del cuerpo, pero involucra problemas éticos por el uso de
embriones. Posteriormente al usar un pequeño grupo de factores de transcripción (c-Myc, Oct4,
Klf4 y Sox-2) se convirtió fibroblastos en células madre pluripotenciales (iPSC). Esta tecnología
de células madre actualmente está teniendo ciertas desventajas, debido a que existen diferencias
en los perfiles de expresión génica ya que conservan una “memoria epigenética” de las células
donde derivan, lo que podría causar problemas al momento de aplicarlas en terapia. En esta
revisión discutimos el papel de algunos factores de transcripción involucrados en las iPSCs y
ESCs.
RESUMEN
Palabras clave: Células madre, epigenética, pluripotencia, factores de transcripción.
INTRODUCCIÓN
144
Las células madre embrionarias (ESCs)
derivadas de la masa celular interna (ICM) del
blastocisto, pueden proliferar indefinidamente
in vitro (auto-renovación), tienen cariotipos
normales y expresan altos niveles de actividad
de la telomerasa. Por ejemplo, durante cuatro a
cinco meses estas células que proliferan sin
diferenciación, siguen siendo cariotipícamente
y fenotípicamente estables y proporcionan una
excelente fuente de material para la terapia
celular en varias enfermedades degenerativas
(Carpenter et al. 2003). Estas células
mantenidas in vitro tienen el potencial de
desarrollar un trofoblasto y dar origen a las tres
capas germinales embrionarias, tales como el
endodermo (epitelio intestinal), mesodermo
(cartílago, hueso, músculo liso y estriado,
epitelio neuronal, ganglios embrionarios) y
ectodermo (epitelio escamoso estratificado).
Estas características únicas las hacen
excepcionalmente valiosas no solo para la
terapia celular, sino también para el
descubrimiento de fármacos, estudios in vitro
de enfermedades y terapia génica (Martin
1981, Thomson 1988, Pan & Thomson 2007).
Debido a los problemas éticos que se han
venido dando por el uso de embriones como
fuente de células pluripotentes, se han
desarrollado nuevas fuentes para obtener
células con las mismas características (Prelle et
al. 2002), se empezó a usar la introducción de
los cuatro factores de transcripción, Oct3/4,
Sox2, Klf4 y c-Myc que originan con éxito la
reprogramación de las células somáticas en
células madre pluripotentes inducidas (iPSC).
Los factores de transcripción son proteínas de
unión a secuencias específicas del ADN que de
alguna manera controlan el nivel de
transcripción de la información genética. Este
tipo de iPSCs tienen muchas de las
características de las ESCs, incluyendo la
pluripotencia y la capacidad de generar
quimeras de línea germinal de ratón (Okita et
al. 2007, Yamanaka 2012). Es por eso que
actualmente es necesario conocer
detalladamente el papel específico de estos
factores de transcripción para lograr una
aplicación terapéutica eficiente. En esta
revisión discutiremos el papel de algunos
factores de transcripción son responsables de
la pluripotencia de las ESCs y las iPSCs cuya
diferencia es clave para los estudios de
reprogramación celular.
Las células madre embrionarias (ESCs)
Gracias a las tecnologías de alto rendimiento
que han facilitado el genoma en estudios de red
de la transcripción, da lugar al descubrimiento
de nuevos factores de transcripción implicados
en el mantenimiento del estado de la célula
madre embrionaria. Mientras que el circuito
transcripcional sigue creciendo, la regulación
epigenética ha ganado la atención como un
proceso importante en la función de las células
madre (Ng et al. 2008; Hosseinpour 2013).
Para hacerse una idea de la regulación
transcripcional de las ESCs, hay 11 regiones
promotoras de genes expresados tales como
SOX2, LIN28, STAT3, NANOG, LEFTB,
TDGF1, POU5F1, FOXD3, TERF1, REX1 y
GDF3. Las ESCs tienen una continua auto-
renovación y diferenciación debido a los
factores de transcripción, Oct4, Sox2, y
Nanog. Además, las combinaciones de
factores, incluyendo siempre Oct4 y Sox2, se
reprograman células somáticas a un estado
pluripotente (Orkin et al. 2008).
ZIC3, un miembro de la familia de factores de
transcripción “dedos de zinc”, juega un papel
importante en el mantenimiento de la
pluripotencia mediante la prevención de
especificación a ciertos linajes endodérmicos
en las células madre embrionarias. La
expresión es reprimida en la diferenciación. La
expresión de ZIC3 en células madre
embrionarias pluripotentes también está
regulada directamente por Oct4, Sox2, y
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Aquino & Tume
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Embryonic Stem cells
Nanog (Lim et al. 2007).
En la figura 1 se muestra varias señales
extrínsecas tales como el factor inhibidor de
leucemia (LIF), proteína morfogénica del
hueso (BMP) y Wnt que apoyan la auto-
renovación y pluripotencia de las ESC a través
de la regulación de los "genes pluripotentes."
Un único factor de transcripción Nanog, es uno
de los efectores claves de estas señales. Los
niveles altos de elevado de Nanog pueden
mantener las ESC de ratón en constante auto-
renovación independiente de LIF y permitir el
crecimiento de células ESC humanas sin
células alimentadoras. Además de las vías de
señales externas, factores de transcripción
intrínsecos tales como Foxd3, P53 y Oct4
también están involucrados en la regulación de
la expresión de Nanog. Funcionalmente,
Nanog trabaja en conjunto con otros factores
pluripotentes clave tales como Oct4 y Sox2
para controlar un conjunto de genes diana que
tienen funciones importantes en la
pluripotencia de ESC. En la figura 2 se muestra
como estos factores clave forman una red de
regulación para apoyar o limitar el nivel de
expresión de cada uno, que mantiene las
propiedades de las ESC (Pan & Thomson
2007).
Figura 1. Regulación de la expresión de Nanog. Foxd3 y Oct4/Sox2 se unen a la región proximal del promotor Nanog y apoyan su
expresión. TCF3 y p53 también se unen al promotor y regular negativamente la expresión de Nanog. LIF (factor inhibitorio de
leucemia) y la señalización de BMP (proteína morfogénica del hueso) y sus efectores intermedios STAT3 y T también pueden
estar involucrados en la regulación de Nanog. Los signos de interrogación muestran la posible participación de otros reguladores,
que aún se desconoce. Tomado de Pan &Thomson (2007).
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Estas células expresan altos niveles de
telomerasa y parecen tener potencial de
crecimiento indefinido. La generación de las
grandes cantidades de células necesarias para
terapias de reemplazo celular requerirá una
población de células que es estable en cultivo a
largo plazo. Se han caracterizado las
propiedades de varias líneas de células madre
embrionarias humanas (hESCs) que han sido
mantenidas en cultivo durante períodos
prolongados. Los análisis cuantitativos
demuestran que todas las líneas celulares
examinadas muestran la expresión del
marcador coherente y conservan un cariotipo
normal después de un cultivo a largo plazo. Las
hESCs se han diferenciado en los derivados de
las tres capas germinales. Específicamente
esto incluye cardiomiocitos, células neurales,
células hepatocitos como las células
endoteliales, y células progenitoras
hematopoyéticas. Estos datos demuestran la
estabilidad cariotípica y fenotípica de las
hESCs y su amplia capacidad de
diferenciación indican que pueden ser una
fuente adecuada de células para múltiples
aplicaciones de la medicina regenerativa.Ya se
ha reportado los defectos de la impronta
genómica que producen en las células madre
embrionarias de ratón, con datos obtenidos
también en primates no humanos y células
madre embrionarias humanas (Huntriss &
Picton 2008). La investigación sobre células
madre humanas y de ratón indica que el
desarrollo, los genes relacionados con el
cáncer, y los genes regulados por la impronta
genómica son particularmente susceptibles a
los cambios en la metilación del ADN. Junto
con la aparición de alteraciones genéticas, la
inestabilidad epigenética necesita ser
monitoreada al considerar las células madre
humanas para fines terapéuticos y
tecnológicos (Pannetier & Feil 2007). Pero a
pesar de que las células madre embrionarias
constituyen una herramienta muy importante
Figura 2. Interconexiones de regulación de factores de transcripción clave en el mantenimiento de la pluripotencia y
autorenovación de las ESC. Los reguladores como Oct4, Nanog, Sox2 y Foxd3 se unen al promotor de uno al otro, y ya sea apoyan
o limitan la expresión del otro, formando una red interconectada de autorregulación. Las flechas conectadas a los factores por las
líneas continuas indican la regulación positiva de un promotor por los factores. Las líneas discontinuas que unen a Oct4 indican
regulación negativa. Tomado de Pan &Thomson (2007).
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Embryonic Stem cells
para la medicina regenerativa en la actualidad.
Estas células madre embrionarias de ratón y las
células madre embrionarias humanas, en
particular, son casi todos derivados de
embriones obtenidos por fecundación in vitro
(FIV) y del cultivo in vitro (IVC), sin embargo,
los embriones manipulados in vitro tienden a
una impronta genómica anormal, respecto a
estas in vivo (Horii et al. 2010). Estas
modificadores epigenéticas juegan un rol
decisivo en la regulación del equilibrio entre la
pluripotencia y la diferenciación mediante la
promoción de cambios en la estructura de la
cromatina (Keenen & Serna 2009).
Otro punto que se debe tomar en cuenta es el
empaquetamiento de ADN en la cromatina a
través de asociaciones con las histonas y
proteínas no histonas que inhiben varios
procesos celulares. La cromatina restringe la
accesibilidad del ADN y genera mecanismos
complejos para la regulación de los procesos
que utilizan ADN. Un rasgo característico de la
cromatina de las ESCs es que los sitios
reguladores específicos, en particular los de un
loci específico de factores de transcripción
parecen estar en un estado de “silencio”, pero
en donde requieren ciertos factores para ser
activados. La variante de la histona, H2AZ se
requiere para el desarrollo temprano de
mamíferos y ha sido implicado en la regulación
de la expresión génica específica de las ESCs.
En las ESC hay una mayor estructura de
cromatina ordenada que es generalmente
dinámica y permisiva a la maquinaria
transcripcional (Saladi 2010).
Los análisis moleculares, celulares y
fisio l ógicos demues t r an q u e l o s
cardiomiocitos derivados de células ES son
funcionalmente viables y que estos derivados
de células exhiben características típicas de las
células del corazón en las primeras etapas de
desarrollo cardíaco. Debido a que la
insuficiencia cardíaca terminal se caracteriza
por una pérdida significativa de los
cardiomiocitos, el uso de la progenie derivada
de células ES humanas representa una posible
fuente para las terapias de trasplante de células
(Wei et al. 2005).
Las células madre pluripotentes inducidas
(iPSCs)
Las células adultas (somáticas) pueden ser
reprogramadas a un embrión usando la
transferencia nuclear de células somáticas
(Kim 2010). Como se muestra en la Figura 3
diferentes tipos de células adultas pueden ser
genéticamente “reprogramadas” a células
madre embrionarias al introducir factores de
transcripción utilizando virus, plásmidos y
proteínas (Yamanaka 2006, Takahashi et al.
2007, Yu 2007). Este tipo de células podría
utilizarse para el estudio de la patogénesis de
enfermedades y también para la terapia basada
en células madre para la regeneración (Wu &
Hochedlinger 2011). Este tipo de células
madre pluripotentes inducidas tienen muchas
de las características de las ESCs, incluyendo
la pluripotencia y la capacidad de generar
quimeras de línea germinal de ratón (Okita et
al. 2007). Otro punto importante es que este
tipo de células madre dan origen a tumores que
pueden ser mortales. Nuevas corrientes
científicas siguen surgiendo para el desarrollo
de las células madre pluripotenciales
inducidas. Una de las ventajas de la tecnología
de iPSC es su simplicidad y reproducibilidad.
Muchos laboratorios empezaron a explorar los
mecanismos subyacentes, modificar los
procedimientos para obtener nuevos
resultados.
Aunque se pueden generar iPSCs, la eficiencia
del proceso sigue siendo baja: típicamente
menos del 1% de fibroblastos transfectados
llega a ser iPSCs (Yamanaka 2009). Es por eso
que actualmente en muchos centros de
investigación se están diseñando y
modificando los protocolos actuales para
obtener mejores resultados. A pesar de esta
desventaja, actualmente se están proponiendo
nuevos métodos con el uso de efectores
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parecidos a activadores de transcripción
(TALE) provenientes de bacterias como una
herramienta para diseñar factores de
transcripción (TF) que se pueden utilizar en la
regulación de potenciadores de genes y la
reprogramación. Existen TF de las ESCs que
han sido utilizados para reprogramar células
somáticas a un estado pluripotente (Tabla 1).
Algunos TF potencian al locus Pou5f1 (Oct4)
induciendo a cambios epigenéticos, en su
expresión, y sustituye exógenos OCT4 en la
reprogramación de fibroblastos de embriones
de ratón (MEFs) a iPSCs. Del mismo modo,
los TF dirigidos a Nanog sirven para
reprogramar células madre del epiblasto a
iPSCs. Por el contrario, represores de TF
dirigidos a los mismos elementos genéticos
inhiben la expresión de estos loci, y bloquean
eficazmente la reprogramación (Gao et al.
2013). Se debe tener en cuenta que el potencial
de una reprogramación de fibroblastos
murinos primarios en iPSCs disminuye a
medida que encaminan a la senescencia
(Utikal et al. 2012).
Figura 3. Diferentes células somáticas y los métodos de liberación de factores de transcripción para la generación de células
madre pluripotentes (iPSCs). Los virus han sido hasta ahora el mejor mecanismo de introducción de estos factores de
transcripción.
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Embryonic Stem cells
Riesgos de tumorigénesis en las iPSCs
Aunque se pueden generar iPSCs, la eficiencia
del proceso sigue siendo baja, típicamente
menos del 1% de fibroblastos transfectados
llega a ser iPSCs (Yamanaka 2009). Además
hay una baja eficiencia en la diferenciación en
estudios con células neurales, además de cierta
inclinación a la heterogeneidad fenotípica y la
inestabilidad (Parsons et al. 2013, Snyders et
al. 2009). Por lo tanto un obstáculo para la
aplicación clínica de iPSCs es el riesgo de
tumorigénesis. Recientemente, se ha
informado de que las iPSCs pueden ser
generadas sin el uso de solo c-Myc (factor de
transcripción tumorigénico) (Takahashi et al.
2007). Por ejemplo se ha creado un método
para generar iPSCs humanas a partir de células
derivadas de la orina libres de virus, sin suero y
sin el oncogén c-Myc, donde presentaron una
alta eficiencia al ser reprogramadas, lo que
ofrece ventajas con respecto a las ESCs. Es por
eso que el establecimiento de estrategias de
reprogramación basados en proteínas o en
tipos de ARN (microARNs) ayudará a generar
iPSCs humanas sin alteraciones genéticas que
dificultarían la aplicación clínica.
El rol de Prdms en células madre
embrionarias (ESC) y células pluripotentes
inducidas (iPSC)
En cultivo, las células madre deben mantener
activamente un estado pluripotente, y deben
reprimir simultáneamente rutas metabólicas
que comprometan la diferenciación en tipos
celulares específicos. Tales funciones son
llevadas a cabo por Prdm1 y Prdm14. La
formación de las células germinales
embrionarias (EGCs) requiere la actividad de
Prdm14 y la pérdida simultanea de la
expresión de Prdm1 (Ancelin et al. 2006,
Durcova-Hills 2008).
Las células somáticas, tales como los
fibroblastos adultos, también pueden ser
convertidas in vitro en células madre con
características de ESC en cultivo. Estas células
madre pluripotentes inducidas (iPSC)
requieren un conjunto de factores como Sox2,
Oct4 (Pou5f1; POU dominio, factor de
transcripción 1 clase 5), Myc y Klf4 (factor 4
similar a Kruppel). En particular, Prdm14
también tiene actividad de inducción a iPSC, y
puede aumentar la actividad de conjunto de
factores de transcripción, incluso si c-Myc o
Klf4 no se incluyen en los protocolos (Pan &
Thomson 2007, Chia 2010 ).
Las proteínas Prdm pertenecen a la familia de
proteínas del dominio SET implicado en la
regulación de la expresión génica. Aunque
algunos miembros PRDM poseen actividad
histona metiltransferasa, los mecanismos
moleculares por los que los otros miembros
ejercen regulación transcripcional aún no se
han descrito. Se ha encontrado que Prdm5 está
altamente expresado en células madre
Factores de transcripción de las ESCs Factores de transcripción de las iPSCs
Brachyury, Pax2, EOMES, Pax6, FoxC2,
PRDM14, FoxD3, Rex-1/ZFP42, FoxF1, SALL1,
FoxH1, SALL4, SOX2, KLF5, SOX7, c-Maf,
SOX15, Max, SOX17, MEF2C, activadores de
STAT, MIXL1, inhibidores de STAT, MTF2,
STAT3 , c-Myc, SUZ12, Nanog, TBX6,
activadores de NFkB/IkB,
TCF-3/E2A, inhibidores de NFkB/IkB, THAP11,
NFkB1, UTF1, NFkB2, WDR5, Oct-3/4, WT1,
Otx2, ZNF206, p53, ZNF281.
KLF2, SOX1, KLF4, SOX2, c-Maf, SOX3, c-Myc,
SOX15, Nanog, SOX18, Oct-3/4, TBX18, p53
Tabla 1. Factores de transcripción de las ESCs y las iPSCs.
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Aquino & Tume
embrionarias de ratón (mESC). Mediante la
combinación de la proteómica y las
tecnologías se ha logrado determinar que
Prdm5 es prescindible para el mantenimiento
de mESC, teniendo una participación
directamente a las regiones genómicas que
intervienen en el desarrollo embrionario
temprano y afecta a la expresión de un
subconjunto de reguladores de desarrollo
durante la diferenciación celular. Es
importante destacar que Prdm5 interactúa con
CTCF, cohesina y el factor de transcripción de
la ARN polimerasa III (TFIIIC) y ocupa
conjuntamente loci genómicos (Galli 2013).
Por el contrario tanto Prdm1 y Prdm14 no
participan en este tipo de transformación en
cultivo de células somáticas de ratón (Chu
2011
Hohenauer & Moore 2012
). No obstante, una vez convertidas estas
células a un estado de pluripotencia requieren
de Prdm14 para mantener su estado
( ).
Similitudes y diferencias entre las ESCs y
iPSC
La inducción de la pluripotencia por factores
de transcripción se ha convertido en un método
común para producir células madre
pluripotentes. Grandes avances se han hecho
en la comprensión del mecanismo por el cual
esto ocurre, en particular en términos de
eventos de regulación de la transcripción y
cambios en la estructura de cromatina, a través
de mecanismos epigenéticos. Sin embargo,
Tabla 2. Diferencias entre las células madre embrionarias y células madre pluripotentes inducidas tanto en ratones
como en humanos (Plath & Lowry 2011).
Características ESCs vs. iPSCs (ratón) ESCs vs. iPSCs (humanos)
Expresión de mRNA
En el pasaje temprano las iPSCs son
diferentes a las ESCs ya que reflejan
la expresión de las células de origen.
En el pasaje temprano iPSCs son
diferentes a las ESCs, reflejando la
expresión de las células diana, pero
en el pasaje tardío las iPSCs se
aproximan a parecerse a las ESCs
en sus perfiles de expresión génica.
Expresión de miRNA
miR-302, 367
Salvo excepciones no se han
encontrado diferencias consistentes
a través de múltiples líneas de IPSC
y ESC.
Expresión de lncRNA
No determinada
Se han descrito diferencias, y
algunos tienen funciones en la
reprogramación.
Modificaciones de Histona
M o d i f i ca c i o n e s p r o b a d a s
(H3K4me3 y H3K27me3) parecen
ser indistinguibles entre las CES y
iPSCs
Dos modificaciones (H3K4me3 y
H3K27me3) parecen que son
idénticas; H3K9me3 es diferente.
Metilación de ADN
Distinta en el paso temprano, en el
pasaje tardío e s casi idéntica.
Se han descrito algunas diferencias.
Estado de activación del
cromosoma X Tanto las iPSCs y ESCs son XaXa.
Las ESC son en su mayoría XaXa,
pero va depender de las condiciones
de cultivo.
Metabolismo Divergen en algunas rutas metabólicas Idénticos o casi idénticos.
H3K4me3, trimetilación de la lisina 4 de la Histona H3; lncRNA, ARN largo no codificante; miRNA, microARN; Xa, Cromosoma X activado
X; Xi, Cromosoma X inactivado.
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Embryonic Stem cells
sólo una pequeña parte del panorama ha sido
dilucidado. Una comprensión del mecanismo
de reprogramación de pluripotencia tendrá
importantes implicaciones para la mejora de la
eficiencia y la calidad de la reprogramación y
la promoción de la aplicación terapéutica de
células madre pluripotentes inducidas (
2011), especialmente en la diferencia
entre ambos tipos de células (Tabla 2) que son
estudiadas a partir de humanos y de modelos
experimentales como ratón.
Las iPSCs al igual que las ESCs dan lugar in
vitro a todos los tipos de tejidos en un
organismo maduro debido a su pluripotencia,
cuyo estado depende de un proceso que
involucra un conjunto de factores de
transcripción que controlan la expresión de
genes que mantienen el estado pluripotente,
tales como Oct-3/4, KLF4, Sox2, y c-Myc que
son esenciales para reprogramar una célula
somática nuevamente a un estado pluripotente
inducida (iPSCs). La búsqueda de nuevos
factores de transcripción claves en el
mantenimiento de la pluripotencia es esencial
para obtener iPSCs con aplicaciones futuras en
la práctica clínica, debido a que el uso de las
ESCs implica el problema ético.
Plath &
Lowry
CONCLUSIÓN
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Received November 16, 2014.
Accepted June 22, 2015.
