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ISSN Versión en linea 1994-9073 ISSN Versión CD ROM 1994-9081
ORIGINAL ARTICLE /ARTÍCULO ORIGINAL
DNA TRANSFECTION OF ANIMAL CELLS AS A TOOL USED IN ANIMAL
BIOTECHNOLOGY
TRANSFECCIÓN DE ADN A CÉLULAS DE ANIMALES COMO HERRAMIENTAS
UTILIZADAS EN BIOTECNOLOGÍA ANIMAL
1 1 1,2
Juan M. Iglesias Artola , Gianfranco Villamonte & H. Mauricio Gonzales Molfino
1Facultad de Ciencias Biológicas – Universidad Ricardo Palma
2Laboratorio de Biotecnología y Fisiología Animal-Universidad Ricardo Palma
Av. Benavides 5450 Santiago de Surco, Lima, Perú
manuel9112@icloud.com
The Biologist (Lima), 13(1), jan-jun: 125-142.
ABSTRACT
Keywords: cells mammalian, DNA, transfection, transgénesis.
Transfection is a process that involves inserting nucleotides into a cell, with the final product
being transgenesis. In recent decades different methods have been developed such as biological,
physical and chemical processes that have allowed the introduction of nucleotides into cells. In
this review, some important aspects of the most used transfection methods in recent years, and
their efficiency in the development of the industry, will be addressed. It concludes with an
analysis of the ethical debates that have been generated within the field of animal biotechnology.
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La transfección es un proceso que consiste en introducir nucleótidos en una célula, cuyo producto
final es la transgénesis. En las últimas décadas se vienen desarrollando diferentes tipos de
métodos como: biológicos, físicos y químicos que han permitido realizar esta introducción de
nucleótidos hacia las células. En está revisión se abordarán algunos aspectos importantes de los
métodos de transfección más utilizados en los últimos años, y su eficiencia en el desarrollo de la
industria. Se concluye con el análisis de los debates éticos que se han ido generando dentro del
ámbito de la biotecnología animal.
RESUMEN
Palabras claves: ADN, células de maíferos, transfección, transgénesis.
efectos de las mutaciones en su función en las
proteínas, las interacciones entre éstas y las
interacciones intercelulares. Además, esta
tecnología ha llevado al desarrollo de animales
transgénicos, a la fecundación in vitro, y a la
posibilidad de usar la transferencia de genes
para tratar desórdenes genéticos (Iannacone
2007).
La transfección ha permitido expresar genes de
interés en células eucariotas. Esta capacidad ha
posibilitado obtener un mejor entendimiento
de la biología celular, la biología molecular y la
genética de las células. Al expresar proteínas
en células de animales, se ha podido entender
aspectos detallados de la síntesis proteica, los
INTRODUCCIÓN
The Biologist
(Lima)
126
Los virus fueron por mucho tiempo la forma
más conveniente de transferir genes a células
mamíferas. Graham & Van der Eb (1973),
utilizaron el adenovirus 2 para transfomar
células de rata, mientras que Cepko et al.
(1984) desarrollaron un retrovirus murínico
para la introducción de secuencias de ADN en
células mamíferas. Si bien los virus
constituyen un medio eficiente para lograr la
transfección in vitro, la construcción de los
vectores es laboriosa, consume tiempo, y tiene
diversas limitaciones para su uso in vivo.
La transfección por medio de vectores virales
es altamente eficiente, otros métodos han sido
desarrollados. Los trabajos realizados por
Pagano et al. (1967) fueron pioneros en su área
al lograr una alta transferencia de genes a
células mamíferas utilizando dietilaminoetil-
dextrano (DEAE-D) mezclado con ARN y
ADN (McCutchan & Pagano 1968). Después,
se demostró que otros métodos también son
eficaces: la encapsulación de ADN utilizando
liposomas (Fraley et al. 1980, Fraley et al.
1981), la fusión inducida por polietilenglicol
del ADN en los eritrocitos fantasma (Straus &
Raskas 1980), la electroporación (Neumann et
al. 1982), los coprecipitados de fosfato de
calcio/ADN (Wigler et al. 1979), y los
policationes/dimetil sulfóxidos (Kawai &
Nishizawa 1984). No existe un método
indicado para todo tipo celular; sino, la
eficiencia de los métodos utilizados varía con
respecto a estos y en general, no fueron muy
eficientes y presentaban una alta toxicidad
celular.
The Biologist (Lima). Vol. 13, Nº1, jan-jun 2015
Iglesias-Artola et al.
Tabla 1. Genes reproteros comunes.
Gen Detección
ß-galoctosidasa(ß-gal)
Enzimático y colorimétrico
Cloranfenicol acetil transferesa (CAT)
Enzimático y radioactivo
Luciferasa Luminiscencia
Proteína ver fluorescente (GFP) Fluorescencia
En la actualidad existen tres grupos grandes de
métodos de transfección que pueden ser
utilizados (Kim & Eberwine 2010): a) los
métodos biológicos, b) los métodos químicos y
c) los métodos físicos.
El objetivo de está revisión es mostrar un
análisis de las principales estrategias
experimentales desde su aplicación hasta las
implicaciones bioéticas que puede tener la
transfección en células de animales.
1. Métodos de transfección
Se han desarrollado diversas técnicas de
transfección que cumplen con el propósito de
transferir ácidos nucléicos al interior de las
células. Existen ciertas características que
permiten una transfección exitosa, estas son:
alta eficiencia en el transporte del ácido
nucléico a la ubicación celular apropiada (el
núcleo para el ADN plasmídico y el citoplasma
para el ARN); baja toxicidad celular; mínima
interferencia con la fisiología celular normal;
uso sencillo y reproducibilidad (Schenborn
2000). Para el caso de la transfección génica
utilizada para terapias se deben tomar
consideraciones adicionales tales como la vida
media y el transporte a un tipo de célula
específica. También se debe decidir si se desea
una transfección estable o transitoria. En esta
sección se discuten los tres principales
métodos de transfección: los métodos
biológicos, químicos y físicos.
1.1 Transfección Transitoria
La transfección transitoria de genes está sujeta
a varios parámetros. El método de
transfección, la fisiología celular y el tipo
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The Biologist (Lima). Vol. 13, Nº1, jan-jun 2015
DNA transfection animal cells
celular (cultivos en suspensión o adherentes),
el método enzimático o colorimétrico utilizado
para cuantificar la actividad del gen reportero,
la cantidad de ADN y la normalización de la
data. El período de expresión del gen en una
transfección génica que varía entre 24 a 72
horas y para el éxito del procedimiento son
críticas las condiciones celulares, con las
células saludables y las que se encuentren en
división las más susceptibles a aceptar
plásmidos recombinantes. Para determinar la
eficiencia y reproducibilidad de la transfección
se puede utilizar un segundo gen reportero que
exprese un producto génico que pueda ser
detectado y medido de manera sencilla. Tal gen
reportero no debe estar presente en el genoma
del tipo celular o, en el peor de los casos, puede
estar presente pero debe ser expresado en bajos
niveles. Los genes reporteros más utilizados se
presentan en la Tabla .
Es importante recalcar que la eficiencia en la
expresión del gen reportero disminuye
drásticamente con la integridad del plásmido y
su habilidad por llegar al núcleo (Zohar et al.
2001).
Los métodos de transfección transitoria
generalmente dirigen el ADN plasmídico al
citoplasma y no está claro qué porcentaje de
estas moléculas son lineales o circulares los
alcanzan el núcleo celular. Además, los
parámetros experimentales deben ser
definidos con cuidado para lograr cierto grado
de reproducibilidad. Se ha sugerido que entre
los diferentes mecanismos, la difusión pasiva
de los plásmidos a través del citoplasma y los
poros nucleares representa la forma más
probable por la cual los genes reporteros
pueden migrar al núcleo celular y ser activados
transcripcionalmente. Sin embargo, existe
evidencia que sugiere otro mecanismo para
explicar la transferencia del ADN plasmídico
al núcleo celular, basándose en señales de
importación del ADN (Vacik et al. 1999,
Zohar et al. 2001). Se piensa que existe una
interacción proteína-ADN plasmídico en el
1
citoplasma y que tales interacciones, con
factores de transcripción producen señales de
localización nuclear, permitiendo la
importación de ADN exógeno al núcleo.
1.2 Métodos Químicos
La eficiencia de la transfección en esta caso
depende de factores tales como la proporción
ácido nucléico / químico, pH de la solución y
las condiciones de la membrana celular, todo
esto lleva a que el proceso de transfección
tenga una baja eficiencia, especialmente in
vivo, comparado con los métodos mediados
por virus. Sin embargo, estos métodos
presentan baja citotoxicidad, no existe
mutagénesis, no hay un ADN extra y no posee
límites de tamaño para el ácido nucléico. Se
debe tomar en cuenta que la eficiencia de la
transfección química varía dependiendo del
tipo de célula a utilizar (Iannacone 2007)
1.2.1. Co-precipitación con fosfato de calcio.
En este método el calcio de asocia con las
cargas negativas del ácido nucléico. La adición
de un buffer fosfato resulta en la precipitación
del ADN con el calcio y el fosfato, formando
pequeñas partículas. Lo que posibilita que el
ADN pueda ingresar a las células por
fagocitosis (Loyter et al. 1982). Para que la
trasfección sea satisfactoria se debe controlar
el tamaño del precipitado; puesto que, se ha
correlacionado los precipitados pequeños con
una mayor eficiencia de transfección (Jordan et
al. 1996). Para esto se debe tomar en
consideración que el tamaño de las partículas
es sensible a la concentración de calcio y ADN,
el pH, la temperatura y el modo en el que el
buffer salino y la solución de ADN son
mezclados durante la precipitación. Para lograr
una alta concentración de ADN, se puede
incluir un plásmido inerte (ADNp) genómico
de alto peso molecular (Strain et al. 1985).
1 . 2 . 2 D E A E - D e x t r a n o
Dietilaminoetildextrano. DEAE-dextrano, es
un reactivo polimérico policatiónico que se
une y transfecta los ácidos nucleicos
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Iglesias-Artola et al.
(McCutchan & Pagano 1968). El complejo
DEAE-dextrano/ADN puede ser tomado por la
célula por endocitosis o fagocitosis (Luthman
et al. 1983, Yang Yang 1997). Se ha encontrado
que el tratamiento con cloroquina incrementa
la expresión del ADN transfectado en algunos
tipos celulares, posiblemente al neutralizar el
pH de los lisosomas en los cuales el ADN es
internalizado (Luthman et al. 1983). Es
necesario que durante el proceso de
transfección la morfología celular sea
monitoreada puesto que el DEAE-dextran
puede ser altamente tóxico para las células.
1.2.3 Liposomas catiónicos El primer lípido
catiónico sintético publicado como un
transportador de ácidos nucleícos fue el
bromuro de 1,2-dioleiloxipropil-3-
trimetilamonio (DOTMA) desarrollado por
Felgner et al. (1987). Desde entonces se han
diseñado diferentes tipos de lípidos catiónicos
sintéticos para la transfección, conservando la
misma estructura general del DOTMA, con un
grupo mono o policationico covalentemente
adherido a una porción lipofílica. La región
catiónica de la molécula se asocia con las
cargas negativas de los ácidos nucléicos. Se ha
correlacionado una carga total positiva o
neutra del complejo lípido/ADN con una
mayor eficiencia de transfección de células in
vitro. Se piensa que la carga positiva o neutra
reduce la repulsión electrostática entre el ácido
nucléico y la membrana celular cargada
negativamente. Se piensa, que el complejo
lípido/ADN ingresa a la célula por endocitosis.
Se puede liberar el ácido nucléico de las
vesículas endosomales utilizando otros
l í p i d o s , t a l e s c o m o
dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE) en la
formulación del liposoma (Farhood et al.
1995).
Existen tres parámetros esenciales que
necesitan ser optimizados para poder utilizar
cualquier liposoma en la transfección (Wong et
al. 1980, Straubiger & Papahadjopoulos
1983). Cada tipo celular requiere que se
determine una cantidad óptima de ADN en
combinación con la concentración del lípido
catiónico. Existe una concentración óptima de
ADN y lípido para cada tipo de células, con una
alta toxicidad en concentraciones elevadas y
baja eficiencia en bajas concentraciones. Otro
parámetro que requiere la optimización es el
intervalo de tiempo de la transfección,
dependiendo de los reactivos y las condiciones
utilizadas, el intervalo de tiempo puede variar
entre 1 a 24 horas. Las incubaciones más largas
son por lo general más tóxicas.
1.3 Métodos físicos
Los métodos de transfección físicos se han
desarrollado recientemente y utilizan una
diversa gama de herramientas físicas para
transportar los ácidos nucléicos al interior de
las células. Estos métodos incluyen la
microinyección directa, el transporte balístico
de partículas, la electroporación, y la
transfección basada en láseres (Mehier-
Humbert & Guy 2005).
1.3.1 Microinyección. En general, el método
de micro inyección introduce de manera
directa el ácido nucléico al citoplasma ó núcleo
(Ikeda et al. 1995, Martinou 1995). Este
método es efectivo en la introducción de los
ácidos nucléicos dentro de las células pero
requiere de mucha habilidad y bastante tiempo
ya que puede ocasionar la muerte celular.
Esta técnica ha sido aplicada exitosamente
para transferir genes a células musculares y
particularmente a células epiteliales (Davis et
al. 1993, Sawamura et al. 2002). Una
limitación de este procedimiento es la falta de
control de parámetros como la concentración
de ADN plasmídico, la degradación y la
eficiencia en la transferencia de genes. Sin
embargo para aplicaciones específicas como la
transferencia ectópica de genes, este
procedimiento tiene ventajas sobre los otros
métodos.
1.3.2 Métodos balísticos. El transporte de
et al.
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DNA transfection animal cells
partículas por medios balísticos emplea
partículas de oro que se conjugan con los
ácidos nucléicos (Lo et al. 1994, O'Brien &
Lummins 2006). Estos conjugados son
disparados a alta velocidad dentro de las
células receptoras “pistola de genes”. Dentro
de la célula el ácido nucléico se disocia de las
partículas de oro. Este método es sencillo y
confiable pero requiere de equipos y causa
daños físicos a las muestras.
Se han diseñado diferentes tipos de
instrumentos para este método. Las ácidos
nucléicos son primero precipitados en esferas
de oro y depositas en hojas de Mylar. Las
partículas de ADN/oro o ARN/oro son
colocadas en el instrumento para después ser
aceleradas por una descarga de alto voltaje y
lanzadas a las células o tejidos de elección. Los
dispositivos comerciales utilizan un pulso de
helio a baja presión para acelerar las esferas de
oro. Con estos dispositivos, las muestras
pueden ser preparadas utilizando tubos
recubiertos con partículas de oro.
1.3.3 Electroporación. Es el método físico
más empleado; sin embargo, se desconoce el
mecanismo exacto, pero se supone que los
pulsos eléctricos perturban las membranas
celulares, produciendo agujeros por los cuales
los ácidos nucléicos pueden ingresar (Inoue &
Krumlauf 2001). Debido a que la
electroporación es un método sencillo y
rápido, es posible transfectar un gran número
de células en poco tiempo una vez que se han
determinado las condiciones óptimas para la
electroporación. Las células son suspendidas
6 7 -1
en una concentración de 10 - 10 células·mL
en un buffer salino de electroporación, buffer
salino HEPES o medio de cultivo sin suero (las
células adherentes necesitan ser tripsinizadas
antes de la electroporación). Las células son
después transferidas a una cubeta estéril y se
añade el ADN a transferir. Para los
experimentos en los que se necesita una
expresión transitoria, se añade ADN super
enrrollado a una concentración de 10-40 µg·
-1
mL ; para una transfección estable se añade
ADN lineal con una concentración de 1-20 µg·
-1
mL . Después de mezclar las células con el
ADN para la transfección, son sometidas a uno
o más electro-shocks, luego estás células son
incubadas en medio selectivo después de un
periodo de recuperación.
Los parámetros más críticos a optimizar
cualquier tipo celular son la magnitud del
voltaje y la duración del pulso de corriente.
Para esto, son efectivas las combinaciones de
voltajes altos con pulsos de corto tiempo o
voltajes bajos con tiempos más largos. Sin
embargo, las condiciones óptimas dependen de
las características de la célula, conjuntamente
con la conductividad del buffer de
electroporación y la temperatura. La
electroporación puede realizarse a temperatura
ambiente o en hielo, pero es necesario
determinar empíricamente las condiciones
óptimas para cada tipo célula (Chu et al. 1987).
El voltaje excesivo y/o la duración de los
pulsos resulta en la muerte celular. Durante el
establecimiento de las condiciones adecuadas
de electroporación se debe monitorear el ratio
entre muerte celular y eficiencia de
transferencia para un tipo celular dado. La
transfección óptima debe ocurrir bajo
condiciones que causen aproximadamente el
50 % de muerte celular (Schenborn 2000).
1.3.4 Láser. La transfección mediada por láser
(también conocida como optoporación o
fototransfección) utiliza un pulso de láser para
irradiar la membrana celular con la finalidad de
formar un poro momentáneo (Shirahata et al.
2001, Barrett et al. 2006). Cuando el láser
induce la formación del poro, los ácidos
nucléicos en el medio son trasferidos dentro de
la célula debido a la diferencia osmótica entre
el medio y el citosol. El método de láser
permite observar a la células transfectada y
hacer poros en cualquier ubicación de la célula.
Este método puede ser aplicado a células
pequeñas, debido a que utiliza un láser, sin
embargo es necesario contar con un sistema de
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Iglesias-Artola et al.
microscopía láser.
Además de los métodos mencionados, existen
otros métodos físicos como el ultrasonido
(sonoporación) y la utilización de un campo
magnético (magnetofección) (Kim et al.
1996, Scherer et al. 2002).
1.4. Transfección Estable
Para la generación de líneas celulares estables
el transgen de interés debe ser co-transfectado
con un marcador de selección que produzca
resistencia a una droga. Para cada ensayo de
transfección estable se debe monitorear de
manera cuidadosa la integración del transgen
en el genoma de la célula blanco. En un
experimento de transfección típico se debe
permitir a las células recuperarse de la
transfección por un periodo de 24 a 72 horas en
la ausencia de selección. Esto permite a la
célula expresar la cantidad necesaria de la
enzima de resistencia para proteger a las
células transfectadas establemente contra la
droga. Después de 48 o 72 horas de la
transfección el medio de cultivo debe ser
cambiado y reemplazado con medio nuevo
complementado con la droga. La selección se
produce dentro de las primera a las tercera
semana posterior a la transfección con cambios
frecuentes del medio de cultivo selectivo.
Finalmente la integridad y número de copias
del gen debe ser determinado por Southern
Blot.
El método más utilizado en la investigación
clínica para lograr una transfección estable es
el de la transfección mediada por virus,
también conocida como transducción (Pfeifer
& Verma, 2001). Este método es altamente
eficiente debido a la naturaleza viral de la
integración en el genoma del huésped. Por
ejemplo, se ha utilizado el virus de la leucemia
murine (MLV) como vector viral para
establecer la expresión sostenible de genes de
interés en humanos (Roesler et al. 2002). El
MLV integra su ADN en el genoma del
hospedero, el cual es posteriormente
expresado. El ADN del MLV integrado se
replica con el genoma del hospedero, lo que
permite la expresión sostenible del gen de
interés (Figura 1).
Figura 1. Diagrama esquemático de dos transfecciones diferentes. A. Transfección estable. El ADN foráneo (rojo) es llevado al
núcleo al pasar por la membrana celular y nuclear. El ADN es integrado al ADN genómico (negro) y expresado de manera
sostenible. B. Transfección transitoria. El ADN foráneo es transportado dentro del núcleo pero no es integrado en el genoma. El
mARN (azul) también es llevado al citosol, en donde es traducido. Los hexágonos representan las proteínas expresadas a partir de
los ácidos nucléicos transfectados. Las flechas negras muestran el transporte del ácido nucléico. Tomado de Recillas-Targa
(2006).
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The Biologist (Lima). Vol. 13, Nº1, jan-jun 2015
DNA transfection animal cells
La citotoxicidad y la inmunogenicidad
representan las mayores desventajas de la
transfección mediada por virus. La
introducción del vector viral puede causar una
reacción inflamatoria y una mutación
insercional, debido a que ciertos vectores
virales se integran de manera azarosa al
genoma del hospedero, lo cual puede afectar a
genes supresores de tumores, activar
oncogenes, o interrumpir genes esenciales
(Woods et al. 2003). Otra desventaja de este
método es que la cápside de un virus tiene
espacio limitado para que un gen extraño
pueda ser infectivo.
2. Aplicaciones de la Transfección
La transfección es una herramienta para la
modificación genética. Gracias a sus múltiples
métodos es posible realizar innumerables
aplicaciones como:
? Estudios genéticos: genes 'knockout' o
'knockdown' para estudiar su expresión
fenotípica.
? Terapia génica: Cura de enfermedades.
? Proteínas recombinantes: Uso de
animales como “bio-fábricas”.
? A l i m e n t o s t r a n s g é n i c o s :
M o d i f i c a c i o n e s g e n é t i c a s
principalmente para alimentación.
? Biorremediación: Reducción del
impacto ambiental de la industria
ganadera.
? Mascotas transgénicas: Peces
brillantes, gatos hipoalergénicos, etc.
A continuación analizaremos cada una de ellas
utilizando ejemplos realizados en empresas y
universidades.
2.1. Estudios Genéticos
La transfección puede ser útil para el estudio
del funcionamiento de genes. Esto se puede
realizar por varios medios: introduciendo un
gen de otro organismo (transgenésis),
mediante un knockout o knockdown que anule
la expresión de un gen (Cryan & Mombereau
2004), aumentando la expresión del gen de
estudio (Yanni 2004), o alterando la estructura
de la proteína que codifica (Ripps et al. 1995).
De esta manera, este procedimiento ha
permitido la realización de estudios sobre el
funcionamiento de diversos genes humanos,
principalmente con fines médicos. Estas
investigaciones incluyen el análisis de la
influencia genética en trastornos psicológicos
y neurodegenerativos, mediante la evaluación
del fenotipo producido utilizando mecanismos
de transfección (principalmente utilizando
modelos murinos). Así vemos que la
transfección ha permitido evaluar el impacto
de la reducción de la enzima SOD-1 en la
neurodegeneración producida en la Esclerosis
Lateral Amiotrófica (ELA) (Ripps et al. 1995).
Asimismo, ha permitido el estudio de la
relación de diversos receptores de
neurotransmisores como la depresión (Cryan
& Mombereau 2004), el autismo, la
esquizofrenia, el Alzheimer, la enfermedad de
Huntington, entre otros (Bucán & Abel 2002).
La transfección también ha permitido evaluar
el impacto de los genes en la regulación
enzimática del metabolismo de lípidos,
r e l a c i o n a d a c o n e n f e r m e d a d e s
cardiovasculares como la aterosclerosis (Yanni
2004).
2.2 Terapia Génica
La terapia génica es una importante aplicación
de la transfección a la medicina. Muchos de sus
usos continúan en experimentación “in vitro”
o en animales, sin embargo, este campo tiene
un gran potencial:
Cáncer.
Enfermedades congénitas.
Curación de heridas, quemaduras y
otras afecciones epiteliales.
La terapia génica se puede emplear para curar
diversos tipos de cáncer mediante múltiples
métodos. Uno de estos métodos es el de
“vacunación” anti-tumoral. Este consiste en
utilizar la transfección para producir antígenos
asociados al crecimiento tumoral. Además, se
puede utilizar esta tecnología para inducir la
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producción de citoquinas que inhiban la
angiogénesis. Asimismo, se puede usar para
inducir el metabolismo de protoxinas por las
células tumorales, haciendo que los
medicamentos contra el cáncer sean de un
impacto más directo y controlado (Vile et al.
2000).
La terapia génica puede asimismo ser utilizada
para suprimir o controlar enfermedades
congénitas, o aliviar sus síntomas, evitando a
su vez los efectos secundarios que podría
producir el uso de fármacos (Spink & Geddes
2004). En el caso de quemaduras, cortes, o
afecciones epiteliales provocadas por diversas
enfermedades (como el acné o el lupus
eritematoso), muchas veces, la curación es
lenta y deja muchas cicatrices debido a la
ausencia o a la baja producción de factores de
crecimiento. La transfección en tejidos
epiteliales, probada a la fecha sólo en cultivos
celulares y ratones, ha comprobado ser útil
tanto para fomentar la regeneración de dichos
tejidos, como para inducir su vascularización y
reducir las cicatrices (Branski et al. 2006,
Strulovici et al. 2007).
2.3 Proteínas Recombinantes
Uno de los principales objetivos de la
modificación genética de animales es la
producción masiva de proteínas. Al buscarse
en estos casos la producción, en lugar de la
expresión en el animal en sí, la modificación
genética en estos casos se enfoca en la leche de
diversos mamíferos (ovejas, cabras, vacas,
chanchos, entre otros). Esta producción masiva
se concentra en proteínas humanas de
aplicación biomédica como algunos factores
de coagulación, fibrinógeno, colágeno,
enzimas y anticuerpos de origen humano;
además de en la producción de proteínas de
origen viral que podrían servir para inmunizar
a las personas ante diversas enfermedades
(Durocher et al. 2002, Kling 2009) (ver Tabla
2).
Tabla 2. Proteínas producidas en diversos animales transgénicos.
132
Proteína Enfermedad/Objetivo
Animal
Activador tisular del Plasminógeno Trombosis
Cabra, ratón
Anti CD137 Enfermedades autoinmunes
Cabra
Albumina de suero humano Mantenimiento de volumen sanguíneo
Ratón, vaca
α –
lacta albúmina Anti-infección
Vaca
α –l antitripsira Deficiencia lleva enfisema
Oveja
α-
glucosidasa Enfermedad de Pompe
Conejo
Antitrombina Trombosis
Cabra
CFTR Fibrosis quística
Oveja, ratón
Calcitomina humana Osteoporesis
Conejo
Colágeno I Reparación de Tejidos
Vaca
Colágeno II Artitritis reumatoidea
Vaca
Decarboxilasa del ac. Glutámico Diabetes tipo I
Cabra, ratón
Factor VIII Hemofilia
Cerdo, Oveja
Fibrinógeno Curación de heridas
Oveja, vaca
Lactoferrina Infección antritica Vaca
msp-1 Malaria
Ratón
Pro542 VIH
Cabra, ratón
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DNA transfection animal cells
Una de estas proteínas con fines terapéuticos,
ATryn (Antitrombina III), producida en cabras
transgénicas creadas por la empresa GTC
Biotherapeutics, fue diseñada para combatir la
trombosis. Esta fue la primera de estas
proteínas en ser aprobada para su
comercialización en Agosto del 2006 por la
Comisión Europea, luego de un reporte
positivo de parte de la EMEA (Agency de
Medicinas Europea) (Schmidt 2006).
Posteriormente, luego de más ensayos, La
FDA aceptó su comercialización en EEUU en
el 2009 ( Fox 2008, Kling 2009).
2.4 Alimentos Transgénicos
La nutrición es una necesidad fisiológica
básica para el ser humano (Maslow 1943). Por
ello, el desarrollo de mejoras en las
propiedades nutricionales de los alimentos es
una prioridad para la humanidad.
Tradicionalmente estas mejoras se han
conseguido mediante la selección artificial, es
decir, eligiendo a animales con características
deseadas para incrementarlas o mantenerlas
mediante su cruce. Sin embargo, esta técnica
demora mucho tiempo y no siempre se
obtienen todas las características deseadas. En
la actualidad es posible realizar estas mejoras
mucho más rápido y con total precisión,
gracias a la transfección.
Un importante rubro alimenticio en el que se
enfoca la transfección es el de la leche. La
leche es un alimento muy consumido a nivel
mundial. No obstante, mucha gente tiene
problemas con su consumo, debido a la
intolerancia a la lactosa, la cual se encuentra en
5% aproximadamente en la leche. Además,
pese a tener una alta concentración de
proteínas, no todas son de alta calidad por lo
cual, no todas nutren de la misma forma a quien
la consume. Por otro lado, la leche tiene una
alta proporción de grasa (3-5% (aprox.)). No
obstante, todas esas desventajas se pueden
superar mediante la transfección (Yom &
Bremel 1993).
Así, por ejemplo, la inhibición de la expresión
de la acetil co-A carboxilasa, que se encarga de
sintetizar grasa en las glándulas mamarias,
puede reducir la concentración de grasa de la
leche. Otra modificación importante, sería la
de inhibir la producción de α-lactalbúmina, la
cual está relacionada con la síntesis de la
lactosa, con lo cual se puede obtener leche con
una concentración muy reducida o libre de ella.
Además, la inhibición de la β-lactoglobulina en
la leche de rumiantes puede eliminar las
alergias relacionadas a su consumo, y otros
ejemplos como el de la expresión de lisozima
humana en la leche (proteína con cualidades
anti-patogénicas y mejoradora de la flora
intestinal) puede mejorar en gran medida la
calidad nutricional de la leche (Maga et al.
2006).
También se ha utilizado la transfección para
mejorar la cantidad de carne en animales. Esta
tecnología se ha aplicado principalmente en
peces, puesto que los métodos de transfección
han sido más eficientes en ellos hasta la fecha.
Quizá el caso más conocido sea el del salmón.
Este animal ha sido modificado para expresar
una mayor concentración de la hormona del
crecimiento, lo que permite un crecimiento
mucho mayor en poco tiempo (Berkowitz &
Kryspin-Sørensen 1994, Ledford 2013) (fig ).
2.5 Biorremediación
El impacto ambiental de los animales
transgénicos suele causar temor a la población
(Verhoog 2003). Sin embargo, en la realidad,
entre otras cosas, uno de los objetivos de la
creación de animales genéticamente
modificados es el de mejorar la calidad
ambiental. Con este fin, se intenta reducir los
productos dañinos para el ambiente producidos
en la acuicultura y ganadería, desde los
medicamentos utilizados (creando animales
resistentes a las enfermedades) hasta los
productos del metabolismo animal (Curran &
Koszarycz 2004, Niemann & Kues 2007).
2
The Biologist (Lima). Vol. 13, Nº1, jan-jun 2015
Iglesias-Artola et al.
Un ejemplo importante de este interés en el
TM
ambiente es el de Enviropig (cerdo
transgénico desarrollado por Golovan et al.
(2001b). El objetivo de su creación fue la
reducción de la contaminación por fosfatos
provocada por la crianza de cerdos. Esta
polución es provocada por la degradación
deficiente de los fitatos provenientes
principalmente de los cereales en animales
TM
monogástricos. El Enviropig fue creado
mediante la inserción de un constructo de los
genes psp (proteína secretora de la parótida) y
appA (polifosfatasa ácida o fitasa, proveniente
de Escherichia coli) que corrigen esta
degradación deficiente, reduciendo la emisión
de fosfatos provenientes del metabolismo de
cerdos (Golovan et al. 2001a, Rowland 2002,
Niemann & Kues 2007).
2.6 Mascotas transgénicas
La transfección permite la obtención de
mascotas con características deseables
comercialmente que, sin embargo, no se
encuentren en estado natural. Estos han creado
un nuevo nicho de mercado con un enorme
potencial de crecimiento (Iannacone 2007).
Un ejemplo muy interesante de mascotas
transgénicas es el de los peces transgénicos.
Inicialmente, Gong y colaboradores en la
Universidad de Singapur, modificaron “peces
cebra”(Danio rerio) para expresar las proteínas
fluorescentes GFP (proteína verde
fluorescente), YFP (proteína amarillo
fluorescente) y RFP (proteína rojo
fluorescente) que actúan en asociación con el
gen mylz2, produciendo diferentes peces de
Figura 2. Comparación del crecimiento de un salmón silvestre y un salmón transgénico con incremento en la expresión de la
Hormona del Crecimiento (Berkowitz & Kryspin-Sørensen, 1994).
134
135
The Biologist (Lima). Vol. 13, Nº1, jan-jun 2015
DNA transfection animal cells
distintos colores fluorescentes. En 2003, la
Universidad de Singapur realizó un trato con
Yorktown Technologies, que comenzó a
comercializarlos como mascotas bajo el
nombre comercial de ”GloFish” luego de una
evaluación de su posible impacto ambiental y
alimenticio llevado a cabo por la FDA, 2003.
Además de estos, existen ”peces Medaka”
(Oryzias latipes) fluorescentes, creados por
investigadores de la Universidad de Taiwan y
comercializados en dicho país (Gong et al.
2003; Scotto & Serna 2013) (Figura 3).
Otro caso importante de mascotas
genéticamente modificadas es el de los gatos
hipoalergénicos, actualmente en desarrollo por
la empresa Felix Pets en EEUU. La expresión
de la proteína Fel-dI (principal alérgeno,
responsable del 90% de los casos de alergia a
gatos en humanos) se puede inhibir,
silenciando el gen que la produce mediante la
inserción de una secuencia llamada neo-r en el
primer o segundo intrón del gen (Avner et al.
2012, Butt et al. 2012).
Figura 3. “Glofish”: Danio rerio, “peces zebra” que expresan proteínas fluorescentes GFP, YFP y RFP que actúan en asociación
con el gen mylz2. Tomado de Gong et al. (2003).
The Biologist (Lima). Vol. 13, Nº1, jan-jun 2015
Iglesias-Artola et al.
3. Bioética, Opinión Pública y
Reglamentación de la Transfección
Como hemos visto, la transfección tiene
múltiples aplicaciones con enorme potencial
para mejorar la nutrición y la salud a nivel
global. Pese a esto, existe un debate continuo
de la opinión pública y los legisladores
respecto a cuales deberían ser los límites de
esta biotecnología, fundamentado tanto en
principios bioéticos como en numerosas
preocupaciones de diversos tipos, tanto
justificadas como injustificadas (Spink &
Geddes 2014, Berkowitz & Kryspin-Sørensen
1994, Verhoog 2003, Berkowitz 1993,
Ormandy et al. 2011).
Existen cuatro principios fundamentales de la
bioética: autonomía (capacidad de decisión de
cada individuo), beneficencia (realizar el bien
a los demás), normal eficencia (no perjudicar a
los demás) y justicia (buscar la igualdad de
derechos) (Cooley et al. 2004, Tsai, 2005).
Siguiendo estos principios, resulta importante
considerar los métodos de transfección per se,
y cómo afectan el bienestar e integridad de los
animales. La mayoría de métodos empleados
son invasivos porque requieren de acciones
como la obtención de muestra seminal,
vasectomía o implantación de embriones.
Además, la mayoría de métodos son
ineficientes (menos de 1 % en mamíferos y
entre 10 y 70 % en peces) que conlleva el
empleo de gran cantidad de animales, y en
muchos casos su muerte. En ese sentido, la
transfección al atentar contra la vida animal,
atenta contra todos los principios
mencionados. Sin embargo, es importante
considerar que dichas acciones invasivas no
son únicas de la transfección, que se está
buscando desarrollar métodos menos
invasivos, que se está investigando para
mejorar la eficiencia de los métodos, y que esta
biotecnología busca mejorar en muchos
sentidos la calidad de vida del ser humano;
argumentos que en conjunto justifican, al
menos en el sentido de la intención, la
transfección dentro de los principios bioéticos
(Niemann & Kues 2007, Mepham et al. 1998,
Christiansen & Sandøe 2000, Lassen et al.
2006, Ormandy et al. 2011).
En segundo lugar, es relevante aplicar los
principios bioéticos al debate sobre la
naturalidad en animales transgénicos. En este
sentido, podemos analizar el concepto de
“telos” planteado por Aristóteles. Este
concepto implica la esencia y propósito de la
existencia de cada ser vivo. En ese sentido, la
mayor parte de organismos modificados
mediante la transfección estarían en conflicto
con su “telos” debido a que su esencia se ha
modificado para desvirtuar su propósito
(Rollin 1998). Sin embargo, pese a que este
argumento es en parte cierto, su aplicación
práctica debe considerarse inválida, puesto que
la crianza tradicional de animales también
modifica esta esencia mediante cruces
selectivos y que el carácter “natural” de los
seres vivos no necesariamente implica que su
fenotipo pueda considerarse bueno tanto para
el animal como para el ambiente (Verhoog
2003, Ormandy et al. 2011).
Otra cuestión importante a considerar, y quizá
la más importante para la opinión pública es la
de los alimentos transgénicos. En esta cuestión
el debate se centra en la seguridad de estos
alimentos para el consumo humano y en si se
debería permitir que se patenten los alimentos,
dejando el control del suministro alimenticio
esencialmente en mano de las empresas. Una
mirada objetiva a ellos nos permite ver que la
única diferencia entre ellos y su versión
“normal” es la proteína insertada. En ese
sentido, probablemente la mejor solución
desde el punto de vista bioético sería informar a
los consumidores sobre la proteína foránea que
contiene el alimento para evitar riesgos a la
salud como potenciales alergias (Berkowitz &
Kryspin-Sørensen 1994, Ledford 2013,
Jefferson 2006).
Finalmente, es importante considerar las
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The Biologist (Lima). Vol. 13, Nº1, jan-jun 2015
DNA transfection animal cells
implicancias bioéticas del posible impacto
ambiental producido por los animales
transgénicos.?En este lado se debe considerar
la posibilidad de la alteración del ecosistema
debida a la introducción del gen foráneo en una
población silvestre. Existe la posibilidad de la
reproducción de peces transgénicos e incluso
de su cruzamiento con individuos no
transgénicos de la misma especie o especies
cercanas (Scotto 2012; Oke et al. 2013). Sin
embargo, esto se podría evitar empleando
métodos que eviten la libre reproducción de
organismos transgénicos como su contención
física o la inducción de poliploidización para
hacerlos estériles (Pandian & Koteeswaran
1998, Wong & Van Eenennaam 2008).
Además, es importante considerar la
posibilidad de que los animales transgénicos
tengan un mayor “fitness” tanto en el caso de
que se puedan reproducir como en el de que no.
Esto depende de cómo afecte la modificación
al animal en el sentido de su resistencia a
enfermedades, facilidad de alimentación, etc
(Robert et al. 2004, Robert et al. 2006).
Un caso práctico que sería adecuado revisar es
el del salmón transgénico. Este animal
desarrollado por investigadores canadienses
en 1989, es propiedad actualmente de la
empresa AquaBounty, la cual ha pasado
muchos años buscando su aprobación en
EEUU. En 2012, luego de largos años de
espera la FDA publicó un borrador de su
posible impacto ambiental, en el cual
declaraba que no existían impactos
significativos que pudiese causar este animal.
Esta ausencia de impactos se explica debido a
un “fitness” reducido causado por una menor
resistencia de estos animales a enfermedades, a
resistentes barreras de contención física
creadas por la empresa y a la producción de
individuos estériles mediante el cruce de
hembras trasgénicas homocigotes con
reversión de sexo y hembras no transgénicas.
Así, como vemos este salmón cumpliría con
los principios de la bioética siempre y cuando
se advierta a la población de su condición
transgénica (Smith et al. 2010, Ledford 2013,
Robert et al. 2004).
Sin embargo, como podemos ver en este caso, a
veces la ética es superada por los intereses
creados. Así vemos que la opinión pública y los
políticos en EEUU han sido influenciados por
empresas criadoras de salmón no transgénico
para evitar la aprobación de este animal. Estas
empresas, principalmente establecidas en los
estados de Alaska, Washington y Oregón
consideran a este salmón una amenaza puesto
que crece en menor tiempo y consume menos
alimento que los que ellos producen, lo que
brindaría a AquaBounty una enorme ventaja
competitiva desde el punto de vista económico.
Debido a esto, a diferencia de los GloFish (los
cuales no afectan a ninguna industria pre-
existente), la FDA aún no le da su aprobación a
este alimento pese a que cumple con todos los
requisitos exigidos y ha superado todos los
plazos establecidos (FDA 2003, Robert et al.
2004, Maxmen 2012, Ledford 2013).
La transfección es una herramienta
biotecnológica de gran potencial, cuya bioética
es debatible en el sentido de su aplicación y
afectación a la “esencia” de los animales. Sin
embargo, cada caso debe ser considerado como
distinto y debe ser evaluado con objetividad
para evitar la influencia de intereses ajenos a la
ética.
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