Implementación de una metodología
toxicológica para la rápida determinación del
CL50 del sulfato de cobre en peces Cebra(Danio
rerio) a 24, 48, 72, 96 y 120 horas de exposición
Implementation of a toxicological methodology for the
rapid determination of copper sulfate CL50 in zebrafish
(Danio rerio) 24, 48, 72, 96 and 120 hours of exposure
Recibido: octubre 15 de 2016 | Revisado: noviembre 17 de 2016 |
Aceptado: diciembre 15 de 2016
Carlos Scotto Espinoza1,2,3
Mercedes Arrilucea Torres2 Gian
CarlosV argas Ramírez2,4 Jocelyn
Salas Chipana2,5 Jeferson Ybañez
Ceferino2,6
Ab s t r ac t
Bioassays have been the traditional method for do-
cumenting the presence of various contaminants in
water. a system was implemented to determine the
Lethal Concentration (LC50) of copper sulfate in the
Zebrafish (Danio rerio) fish. For this test, diffe-rent
exposure times (24, 48, 72, 96 and 120 hours) were
planned and executed. It was determined that the
LC50 was 0.1875 mg / L at 96 hours of exposure.
Key words: bioassays, zebrafish, CL50,
copper sulphate
Re su m e n
Los bioensayos han sido el método tradicional
para documentar la presencia de diversos contami-
nantes en el agua. Se implementó un sistema para
determinar la Concentración Letal Media (CL50)
del sulfato de cobre en los peces Cebra (Danio re-
rio). Para ello se realizaron ensayos a diferentes
tiempos de exposición (24, 48, 72, 96 y 120
horas). Se determinó que la CL50 fue de 0.1875
mg/L a las 96 horas de exposición.
Palabras clave: bioensayos, pez Cebra,
CL50, sulfato de cobre
1 Laboratorio de Mejora Genética y Reproducción
Animal. Facultad de Ciencias Naturales y Matemáti-
cas. Universidad Nacional Federico Villarreal.
2 Facultad de Ingeniería Ambiental. Universidad
Pri-vada del Norte.
3 Correo: carlosscottoespinoza@gmail.com
4 Correo: giancarlosvargasramirez@outlook.com
5 Correo: jocelyn.salas@hotmail.com
6 Correo: jeferson.7.1997@gmail.com
DOI: http://dx.doi.org/10.24039/cv20164272
| Cátedra Villarreal | Lima, perú | V. 4 | N. 2 | 185-190 | julio-diciembre | 2016 | issn 2310-4767 185
Carlos Scotto Espinoza, Mercedes Arrilucea Torres, Gian Carlos Vargas Ramírez,
Jocelyn Salas Chipana, Jeferson Ybañez Ceferino
Introducción
En la actualidad, el sulfato de cobre (CuSO4)
tiene muchas aplicaciones en sectores muy di-
versos del quehacer humano. En la ganadería, es
un aditivo en la alimentación que mejorar el
crecimiento de los animales. Entre sus nume-
rosos usos industriales, cabe destacar sus apli-
caciones como conservante o aditivo de pega-
mentos, entre otros. En la agricultura, es la base
de la fabricación de fungicidas agrícolas. Mien-
tas que la acuicultura lo utiliza como alguicida,
molusquicida y corrector del déficit de cobre en
suelos (Mendoza, 2009; IQV, 2013).
Sin embargo, el sulfato de cobre puede ser
altamente tóxico para los animales y especial-
mente los peces, ya que al ser aplicado en do-
sis subletales, los iones de cobre interrumpen
la osmorregulación de las branquias y causan
daños mecánicos y fisiológicos en los organis-
mos (Boyd & Massaut, 1999). Por esta razón,
se han desarrollado ensayos de toxicidad que
se emplean para diferentes fines y proporcio-
nan resultados útiles para la protección de la
salud pública y de la vida acuática frente al
impacto causado por la introducción de con-
taminantes en las aguas, como los relaves mi-
neros, los cuales, debido a un mal tratamiento
frecuentemente alcanzan las zonas hídricas
(ríos, lagos y/o lagunas) aledañas a las opera-
ciones mineras (OMS, 1997; Millones, 2012).
Debido a que no es viable económicamente
determinar la toxicidad específica de cada una
de las sustancias tóxicas que pueden aparecer en
el agua, se efectúa el ensayo de toxicidad del
efluente global mediante la utilización de
organismos acuáticos y la observación de res-
puestas (Montoya, 1981, Metcalf, 1995; Velas-
co, 2006).
Los peces Cebra (Danio rerio) son especies
de agua dulce con características muy favo-
rables para la investigación porque crecen en
poco tiempo, son de fácil manipulación y cui-
dado (Lozada Gurán et al., 2002).
En esta investigación se utilizaron los pe-
ces cebra para determinar la CL50 del sulfato
de cobre y el tiempo de tolerancia fisiológica
de dicha especie acuática al sulfato de cobre.
Método
Materiales
• Trescientos peces Cebra
• 50 l. de agua tratada (San Luis)
• Medio ciento de envases de 1 L.
• Guantes de látex
• Guardapolvo
• Red para peces de acuario
• 50 gramos de sulfato de cobre
Preparación de peces Cebra
Los peces fueron aclimatados en el Labora-
torio de Mejora Genética y Reproducción
Animal de la Facultad de Ciencias Naturales
y Matemática de la Universidad Nacional Fe-
derico Villarreal, donde fueron mantenidos a
una temperatura de 25 °C. Los ejemplares se-
leccionados estaban clínicamente sanos, con
el peso y talla lo más uniforme posible. Du-
rante la fase de aclimatación, los peces fueron
mantenidos en acuarios de vidrio con capa-
cidad 10 litros y alimentados ad libitum dos
veces al día durante dos semanas. El agua de
la pecera fue mantenida con un sistema de re-
circulación.
El día previo al ensayo, los peces no
fueron ali-mentados
Ensayo preliminar seriado para determinar
el potencial CL50 con sulfato de cobre
Se prepararon diez concentraciones distintas de
sulfato de cobre: 2,50; 1,75; 1,50; 1,25; 1,00;
0,75; 0,50; 0,25; 0,125 y 0,625 mg/L. Luego, se
enrazó a un volumen final de 500 mL con agua
desgasificada de la marca San Luis.
Se utilizó como control agua
desgasificada sin sulfato de cobre.
A cada concentración se le agregó seis pe-
ces Cebra por triplicado. Y se observó los
resultados a las 24 horas de exposición
(Fi-gura 1).
186 | Cátedra Villarreal | V. 4 | No. 2 | julio-diciembre | 2016 |
Implementación de una metodología toxicológica para la rápida determinación del CL50 del sulfato de cobre en peces Cebra(Danio rerio) a 24,
48, 72, 96 y 120 horas de exposición
Figura 1. Ensayo preliminar para determinar el CL50 del sulfato de cobre en peces Cebra a las 24 horas.
Selección de cinco concentraciones
cercanas al CL50 del sulfato de cobre a
24, 48, 72, 96 y 120 horas de exposición
Se prepararon cinco concentraciones
distintas de sulfato de cobre (0.75, 0.50,
0.250, 0.1875 y 0.0625 mg/L).
Luego, se enrazó a un volumen final de 500
mL con agua desgasificada de la marca ®San
Luis. A cada concentración se le agregó seis
peces Cebra cumpliendo con las 3 Rs de
bioé-tica con animales de
experimentación (Rusel & Burch. 1959).
Se utilizó como control agua
desgasificada sin sulfato de cobre.
A cada concentración se le agregó seis
peces Cebra por triplicado. Y se observó
los resulta-dos a las 24, 48, 72, 96 y 120
horas de exposi-ción (Figura 2).
Figura 2. Ensayo final para determinar el CL50 del sulfato de cobre en peces Cebra realizado a las 24, 48,
72, 96 y 120 horas de exposición.
Recolección de datos de mortandad
Por medio de observación directa se verificó
cada 24 horas la secuencia de muerte de los
peces que fue registrada diariamente hasta
completar los cinco días de exposición, con el
fin de determinar el CL50 donde se produzca
el 50% de mortandad.
Análisis estadístico de resultados
Se utilizó el programa de computación Pro-
bit 2013 para el análisis de datos, con el fin
de calcular la CL50 mediante una regresión
concentración-respuesta. La regresión Probit es
un tipo particular de regresión lineal que se
construye para conocer la relación que existe
entre una variable independiente (la concen-
tración de tóxico) y una variable dependien-te
(mortalidad) para una especie y un tiempo de
exposición al tóxico (normalmente 48 o 96
horas). Para ello la respuesta acumulada de los
organismos (mortalidad acumulada) se trans-
forma a unidades probit (eje Y) y la concentra-
ción de tóxico se transforma logarítmicamen-
| Cátedra Villarreal | V. 4 | No. 2 | julio-diciembre | 2016 | 187
Carlos Scotto Espinoza, Mercedes Arrilucea Torres, Gian Carlos Vargas Ramírez,
Jocelyn Salas Chipana, Jeferson Ybañez Ceferino
te (eje X). El resultado es una recta en la cual
podemos interpolar el 50% de la respuesta y
conocer qué concentración de tóxico causa
esa respuesta (CL50). La CL50 o la concen-
tración letal 50, es la concentración de tóxico
necesaria para causar la muerte del 50% de la
población de estudio en un tiempo determi-
nado (Finney & Stevens, 1948).
Además, se determinó el Coeficiente de Corre-
lación de los resultados de mortandad de los pe-
ces para verificar la consistencia de los mismos.
Resultados
En la Tabla 1 se muestra los resultados preli-
minares de peces Cebra muertos versus peces
cebra vivos (n = 6) a las 24 horas de exposición
con sulfato de cobre para determinar el CL50.
Tabla 1
Resultados obtenidos del ensayo
preliminar seriado para determinar el
potencial CL50 con sulfato de cobre.
Concentración de
Peces vivos y muertos
a las 24 horas de ex-
CuSO4 (mg/L)
posición
2,5
6M/0V
1,75
6M/0V
1,50
6M/0V
1,25
6M/0V
1,00
6M/0V
0,75
6M/0V
0,50
6M/0V
0,25
5M/1V
0,125
1M/5V
0,0625
0M/6V
0,00*
0M/6V
M = Peces muertos, V = Peces vivos. (*) = Control
Se encontró que había 100% de animales
vi-vos una concentración de 0,0625 mg/L y
una mortalidad de cinco animales de seis en
total (5M/6V) a una concentración de 0,25
mg/L. Por lo que, el CL50 debe encontrarse
en este rango de concentraciones.
Del ensayo preliminar se realizó un ensayo
fi-nal cuyas concentraciones fueron: 0,5
(100% de mortalidad); 0,4; 0,3; 0,2; 01875
(posible 50% de mortalidad) y 0,1 mg/L
(0% de mor-talidad).
Tabla 2
Resultados obtenidos del ensayo preliminar
seriado para determinar el potencial CL50
con sulfato de cobre a concentraciones de
0,5; 0,4; 0,3; 0,2, 01875 y 0,1 mg/L.
Concen-
Tiempo de exposición en horas (h)
tración
de
2
4
h
4
8
h
7
2
h
9
6
h
1
2
0
h
CuSO4
(mg/L)
0,5
6M/0V
6M/0V
6M/0V
6M/0V
6M/0V
0,4
6M/0V
6M/0V
6M/0V
6M/0V
6M/0V
0,3
5M/1V
5M/1V
6M/0V
6M/0V
6M/0V
0,2
2M/4V
2M/4V
4M/2V
5M/1V
6M/0V
0,1875
1M/5V
1M/5V
2M/4V
3M/3V
4M/2V
0,1
0M/6V
0M/6V
1M/6V
2M/3V
2M/3V
0,00*
0M/6V
0M/6V
0M/6V
0M/6V
0M/6V
M = Peces muertos, V = Peces vivos. (*) = Control
En la Figura 3, se muestra la curva de Probit
donde el coeficiente de correlación entre la
concentración del sulfato de cobre y la mor-
talidad de peces Cebra a las 96 horas de ex-
posición fue de 0,1875mg/l con un
coeficiente de correlación de 0,865.
Figura 3. Batería de concentraciones de sulfato de cobre
con peces Cebra.
188 | Cátedra Villarreal | V. 4 | No. 2 | julio-diciembre | 2016 |
Implementación de una metodología toxicológica para la rápida determinación del CL50 del sulfato de cobre en peces Cebra(Danio rerio) a 24,
48, 72, 96 y 120 horas de exposición
Figura 4. Ensayo para determinar el grado de asociación entre el número de peces cebra muertos y la
concentración del sulfato de cobre a las 96 horas de exposición.
Discusión
La CL50 es útil en ecotoxicología para: (a)
comparar sensibilidades entre diferentes espe-
cies para un mismo tóxico, (b) comparar toxi-
cidad de varios compuestos para una misma
especie, (c) evaluar el riesgo ambiental de los
tóxicos y (d) usarlo como parámetro se sue-le
utilizar en exposiciones cortas (agudas o a
corto plazo), y por tanto, emplear concentra-
ciones relativamente altas de tóxico (Boyd &
Massaut, 1999).
En esta investigación se determina y
evalúa mediante la obtención de la CL50 para
diferen-tes tiempos de exposición con sulfato
de co-bre. Este es un compuesto de bajo
costo, muy usado principalmente para el
tratamiento de ectoparásitos y enfermedades
bacterianas, así como fungicida y herbicida
(Reddy et al. 2006). Noga (1996) recomienda
que para evi-tar efectos tóxicos, la dosis del
sulfato de cobre debe ser inferior a 0,75 ppm.
Sin embargo, en el presente informe se
demostró que es nece-saria tan solo la cuarta
parte de dicha concen-tración para matar a la
mitad de la población existente en un
determinado lugar a 96 horas de exposición.
Los efectos de la toxicidad por sulfato
de cobre evaluados permitirán su
implementa-ción dentro de un sistema de
alerta de riesgo toxicológico utilizando al
pez Cebra ( Danio rerio) como un buen
bioindicador de la to-xicidad en poco
tiempo y con poca destreza labotatorial.
Conclusiones
La CL50 del sulfato de cobre hallada en el
pre-sente trabajo fue de 0.01875 mg/L.
El tiempo de exposición que tuvieron los
pe-ces para hallar la CL50 fue de 96 horas.
Se determinó que el sulfato de cobre es
tóxico para los peces cebra (Danio rerio).
Se implementó una nueva metodología rápida
y de bajo costo para determinar el CL50 en po-
blaciones de peces cebra donde se utiliza vo-
lúmenes pequeños (500mL) de agua mineral
desgasificada y que puede ser implementada
como un sistema de alerta de riesgo toxicoló-
gico a escala artesanal o de bajo presupuesto
como son las condiciones en campo.
| Cátedra Villarreal | V. 4 | No. 2 | julio-diciembre | 2016 | 189
Carlos Scotto Espinoza, Mercedes Arrilucea Torres, Gian Carlos Vargas Ramírez,
Jocelyn Salas Chipana, Jeferson Ybañez Ceferino
Referencias
Boyd, C. & Massaut, L. (1999). Risk
associated with use of chemicals in
pond aquacul-ture. Aquacultural
Engineering, 20, 113-132.
Finney, D. J. & Stevens, W. L. (1948). A
table for the calculation of working
probits and weights in probit analysis.
Biometri-ka, 35(1-2), 191-201.
IQV. (2013). Sulfato de cobre. Recuperado de
http://www.iqvagro.com/0/productos/
cobre/sulfato-de-cobre
Lozada, J., Palmeros, B., Ramírez, M. &
Fer-nández, M. (2012). El pez cebra:
una especie modelo. Revista de
divulgación científica y tecnológica de
la universidad veracruzana, 25, 1-4.
Mendoza, R. (2009). Toxicidad aguda del sulf-
ato de cobre en postlarvas de camarón.
Cryphiops caementarius. Archivos de
Zootecnia, 58(221), 103-110.
Metcalf, E. (1995). Ingeniería de aguas resid-
uales. Tratamiento, vertido y reutilización
(3ª ed.). New York: McGraw-Hill.
Montoya, J. (1981). Pruebas de toxicidad agu-
da CL50 con algunos organoclorados, en
dos especies continentales: mojarra am-
arilla (peteniakraussiisteindachner) y
la tilapia (Rendalli boulenger) a partir
de ensayos exploratorios (Tesis
profesion-al). Universidad de Bogotá
Jorge Tadeo Lozano, Colombia.
Noga, E.J. (1996). Fish diseases,
diagnosis and treatment. St. Louis,
Missouri: Mos-by-Year Book, Inc.
OMS. (1997). Programa internacional de segu-
ridad de sustancias químicas. seguridad
química; principios básicos de toxicología
aplicada. la naturaleza de los peligros
químicos. (2ª ed.). Lima, Perú: CEPIS.
Reddy, R., Pillai, B. & Adhikari, S. (2006).
Bioaccumulation of copper in postlar-
vae and juveniles of freshwater prawn
Macrobrachium rosenbergii (de Man)
exposed to sublethal levels of copper
sul-fate. Aquaculture, 252, 356-360.
Rusel, W. M. S & Burch, R. L. (1959). The
principles of Humane Experimental
Tech-nique. London, UK: Methuen.
Velasco-Santamaría, Y.M., Gómez-Manrique,
W. & Calderón-Bernal, J.M. (2006). Toxi-
cidad aguda del sulfato de cobre (CuSO4)
en alevinos de cachama blanca (Piarac-tu
sbrachypomus) bajo condiciones de aguas
blandas. Orinoquia, 10(1), 64-70.
190 | Cátedra Villarreal | V. 4 | No. 2 | julio-diciembre | 2016 |
