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ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL
DEVELOPMENT OF FASCIOLA HEPATICA AND ITS BIOTIC POTENTIAL IN RATTUS
NORVEGICUS HOLTZMAN
DESARROLLO DE FASCIOLA HEPATICA Y SU POTENCIAL BIÓTICO EN RATTUS
NORVEGICUS HOLTZMAN
1,2 1,3
Paul Iturbe Espinoza & Flavia Muñiz Pareja
Abstract
Keywords: coproparasitological analysis - experimental animals - Fasciola - Rattus.
Suggested citation: Iturbe-Espinoza, P & Muñiz-Pareja, F. 2013. Development of Fasciola hepatica and its biotic potential in
Rattus norvegicus Holtzman. Neotropical Helminthology, vol. 7, n°2, jul-dec, pp. 255 - 263.
1 Facultad de Ciencias Biológicas. Centro de Investigaciones Parasitológicas Regionales Inka-CIPRI Universidad Nacional de San Antonio Abad de Cusco
Av. La Cultura 733 Cusco
2 3
iturbe555@hotmail.com, fmpegog@yahoo.es
Neotrop. Helminthol., 7(2), 2013
2013 Asociación Peruana de Helmintología e Invertebrados Afines (APHIA)
ISSN: 2218-6425 impreso / ISSN: 1995-1043 on line
Resumen
Palabras clave: análisis coproparasitológico – animal experimental – Fasciola – Rattus.
Fasciola hepatica es un digeneo que tiene un ciclo biológico complejo, que incluye un
hospedador vertebrado en el que acontece su reproducción sexual, verificable en animales de
experimentación, por lo que el objetivo del presente estudio fue estimar la potencia invasiva (PI),
extensión de la invasión (EI) y el potencial biótico de este digeneo, en Rattus norvegicus albinus
de la cepa Holtzman experimentalmente infectadas por F. hepatica, Para ello se obtuvieron
metacercarias de caracoles infectados en la naturaleza de dos procedencias, las que fueron
administradas en número de veinte en la dieta semisólida a seis ejemplares de R. norvegicus,
mantenidas en bioterio bajo condiciones ambientales controladas. Realizándoles su
coproparasitoscopía mediante la técnica de concentración simple por sedimentación desde los 86
hasta los 100 días post infección, finalmente procediendo con las necropsias. Resultando la
producción promedio de huevos por adulto de F. hepatica 9135,70 ± 2196,8; la potencia invasiva
de 6,67 a 8,33% y la extensión de la invasión de 66,67 % en R. norvegicus.
Fasciola hepatica is a digenean that has a complex life cycle which includes a vertebrate host in
which its sexual reproduction occurs, verifiable in experimental animals. The objective of this
study was to estimate the invasive power (PI), extension invasion (EI) and the biotic potential of
this digenean in Rattus norvegicus albinus Holtzman strain, infected experimentally with F.
hepatica's metacercariae which was obtained from infected snails in nature, in two provinces.
Twenty metacercariae were administered in semisolid diet to six specimens of R. norvegicus,
which were maintained in bioterio under controlled environmental conditions. We made copro-
parasitological analysis by simple concentration and sedimentation technique from the 86 to 100
days post infection and then proceeded with necropsies. We observed that the average production
of eggs by adult F. hepatica was 9135.70 ± 2196.8, invasive power from 6.67 to 8.33% and the
extent of invasion of 66.67% in R. norvegicus.
Iturbe-Espinoza & Muñiz-Pareja
Fasciola hepatica and its biotic potential in Rattus
256
Los adultos de F. hepatica en hospedadores
humanos y ratas inducen una considerable
reacción tisular con calcificación de los
conductos biliares (Boray et al., 1984). En este
contexto, Rattus norvegicus (Berkenhout, 1769)
es un modelo adecuado en fasciolosis por su
nivel de resistencia, similar al de los humanos
(Boray et al., 1984). Además, en la fasciolosis de
humanos, el parásito que con frecuencia suele
localizarse en el canal biliar, lo dilata (Valero et
al., 1998), alcanzando entre 7 a 30 mm,
similarmente en la fasciolosis en ratas, dicho
canal biliar oscila entre los 4 a 17 mm (Ordoñez,
2009). Este hecho permite considerar que el
modelo rata es adecuado para estudiar el
desarrollo de este tremátodo adulto (Ordoñez,
2009) y extrapolar los resultados a infecciones
humanas, considerando además a la rata como
mejor hospedador experimental por su baja
mortalidad; fácil y económico manejo; lo cual
induce a utilizarla en el presente estudio, con el
objetivo de estimar el potencial biótico (cantidad
de huevos emitidos por parásito); determinar la
potencia invasiva (PI), definida como el número
de adultos de F. hepatica localizados en el
parénquima y en los conductos hepáticos,
comparados con el número de metacercarias
inoculadas en cada hospedero (Olazabal et al.,
1999; Ordoñez, 2009); y extensión de la
invasión (EI), definida como el porcentaje
obtenido al comparar la cantidad de
hospedadores encontrados parasitados con la
cantidad de animales inoculados (Olazabal et
al., 1999) de F. hepatica en condiciones
controladas de laboratorio, en el hospedador
definitivo R. norvegicus utilizado.
Para la obtención de metacercarias, se tuvo a
disposición caracoles Galba truncatula (Müller,
1774) infectados naturalmente con F. hepatica
procedentes del sector La Joya, a orillas del río
Pitumayo, Anta, Cusco, ubicado a los 13º 28'
51.0'' LS, 72º 16' 44,9'' LW y 3268 msnm (grupo
A) y del arroyo Rumitabla, San Jerónimo-
Cusco, ubicado 13º 32' 21.9'' LS, 71º 52' 15,6''
LW y 3324 msnm (Grupo B), en el Laboratorio
La fasciolosis es una zoonosis parasitaria
causada por el digeneo estenoxénico Fasciola
hepática Linnaeus, 1758 (Wilford, 1978),
tremátodo que infecta el parénquima y
conductos biliares del ganado ovino, bovino,
caprino, porcino, equino, y otros animales
herbívoros que ingieren metacercarias durante el
pastoreo, al beber el agua contaminada, o al
comer henos y ensilados mal realizados; e
infectándose accidentalmente el hombre
(Becerril & Romero, 2004) mediante el
consumo de berro fresco, alfalfa, lechuga y agua
de bebida (Carrada, 2007); causando un proceso
crónico que produce trastornos digestivos y de la
nutrición (Euzéby, 2001; Quiroz, 2003).
Las metacercarias ingeridas, desenquistan en la
luz del intestino por acción de la bilis y otros
jugos digestivos, dando salida a adolescarias,
capaces de atravesar la pared intestinal y 3 h
después estar en la cavidad peritoneal, donde
permanecen 3 a 16 días (Alcaíno & Apt, 1989)
posteriormente reptan por el peritoneo, penetran
por la cápsula de Glisson, migrando por el
parénquima hepático, durante 6 a 7 semanas
(periodo migratorio agudo) (Alcaíno & Apt,
1989). La intensidad de los síntomas y signos
está condicionada por la magnitud de la carga
parasitaria, pudiendo desarrollar una hepatitis
hemorrágica y necrotizante con o sin
hemoperitoneo, mortal en ocasiones. Más tarde,
el parásito se aloja dentro de los conductos
biliares, generando esclerosis y dilatación, e
incluso a veces obstrucción aguda del colédoco
y síndrome de obstrucción biliar ictérico
(periodo biliar crónico) (Carrada, 2007). Dentro
de los conductos biliares, F. hepatica suele
autofecundarse o hacer fecundación cruzada
(Carrada, 2007), generando huevos sin
embrionar que pasan al intestino y salen con la
materia fecal (Euzéby, 2001). Pudiendo
alcanzar una longevidad de 11 años (Botero &
Restrepo, 2004).
INTRODUCCIÓN
MATERIALES Y MÉTODOS
Neotrop. Helminthol., 7(2), 2013
termine de comer completamente su gomita.
Las ratas inoculadas fueron custodiadas y
mantenidas en dos jaulas del Bioterio de la
Facultad de Medicina Humana (MH 113-2 y MH
113-3) de la UNSAAC (Fig. 2), a condiciones
ambientales controladas: temperatura entre 20 –
24ºC regulada por un calefactor de aceite Focus
2000 CATA, humedad relativa de 55 ± 10%
medidas por un termohigrómetro digital
Radioshack®, luz artificial mediante
fluorescentes con incidencia oblicua (Nail &
McKay, 2003), y un fotoperiodo de 12 h.
Además los lechos de las ratas fueron
acondicionados con viruta de eucalipto,
esterilizados en autoclave (121 ºC, 15 libras de
presión durante 15 min) (Sharp & La Regina,
1998) suministrando maíz, purina y pellet para
gatos como alimento también esterilizada en
autoclave, y como bebida agua hervida entibiada
(Sharp & La Regina, 1998). Diariamente se
recambiaron los lechos y se desinfectaron todas
las superficies de los ambientes del Bioterio con
solución de hipoclorito de sodio al 0,05%.
A partir del día 30 post-infección, se realizó los
análisis coproparasitoscópicos cualitativos,
colectando los escíbalos de ratas inoculadas para
verificar el día de inicio de la ovoposición de los
adultos de F. hepatica (periodo prepatente), día a
día. Posteriormente desde los 86 -100 días post-
infección, las ratas fueron distribuidas en jaulas
individuales para realizar los análisis
cuantitativos diarios, considerando que la
emisión de huevos por individuo muestra fuertes
fluctuaciones diarias en murinos (Ordoñez,
2009). Se colectó los escíbalos del día, de cada
rata en frascos de plástico que se transportaron al
Laboratorio de Parasitología debidamente
cerrados y marbetados, realizando el método de
concentración simple por sedimentación de
Lumbreras, especialmente útil para la búsqueda
de huevos F. hepatica (Beltrán et al., 2003).
Homogeneizándolas con varilla de vidrio en
agua declorada, para filtrarlas en tamices de 60
hilos/pulgada trasvasándolas a copa de
sedimentación de 250 mL, dejándolas
sedimentar por 30 min, descartando luego las 2/3
partes del volumen y aforando a 250mL con
agua declorada, repitiendo este lavado entre 3 ó
de Parasitología C-224 de la Facultad de
Ciencias Biológicas; situados en la Ciudad
Universitaria de Perayoc, Av. de la Cultura 733.
Seleccionándolos por poseer mayor tamaño
como indican Wilson & Denison (1980),
Ginetsinskaya (1988) y Dalton (1999); teniendo
en cuenta que los limneidos colectados
provienen de zonas endémicas para fasciolosis.
Se diseccionó 100 caracoles de cada grupo
mediante la técnica de Olazabal et al. (1999),
encontrándose estadíos larvales de F. hepatica
sólo en caracoles de más de 9 mm de longitud
con 1% de caracoles infectados en el grupo A, y 2
% de caracoles infectados en el grupo B,
evidenciando al microscopio el movimiento y la
morfología de redias y cercarías de F. hepatica,
las cuales fueron apartadas de los restos del
caracol con la ayuda de agujas enmangadas de
0,40 mm de ancho x 13mm de largo; una h
después, las cercarías iniciaron su metamorfosis
a metacercarias, perdiendo su cola y enquistando
en la superficie de cada placa Petri, éstas se
mantuvieron 7 días incubadas en agua a 26ºC, en
presencia de una lámpara de luz de 25 Watts,
para garantizar su maduración y viabilidad
(Ginetsinskaya, 1988; Alcaino & Apt, 1989).
Para la inoculación de metacercarias en seis R.
norvegicus de la cepa Holtzman, de sexo
masculino, de 32 a 36 g de peso y de 38 días de
nacidas, fueron marbetadas en la base de su cola
con un marcador permanente no toxico,
distribuidas en jaulas individuales y mantenidas
en ayunas hasta su inoculación, mediante su
primer alimento del día conteniendo 20
metacercarias de F. hepatica, dosis indicada por
Olazabal et al. (1999) y Ordoñez (2009).
Utilizando el método de administración oral en
ratas ideada por Dabrowski et al. (2004) que
consiste en la preparación de gomitas de gelatina
con leche y su administración como vehículo
aditivo oral de infección, que es ventajoso por
ser económico, práctico, sin estrés para el
investigador ni animales, y evita lesiones de
esófago. Transfiriendo con el uso de dos agujas
enmangadas, en observación simultánea de dos
estereoscopios 20 metacercarias del interior de
las placas Petri donde enquistaron, hacia la
superficie de cada gomita (Figs. 1).
Confirmándose después de 20 min que cada rata
257
Iturbe-Espinoza & Muñiz-Pareja
Fasciola hepatica and its biotic potential in Rattus
parénquima hepático. Luego se aisló el hígado
cortando el canal biliar principal a la altura de su
unión con el intestino, siendo fácil detectar si
existen adultos de F. hepatica en ellos. Y de esta
manera determinar la potencia invasiva (PI) y la
extensión de la invasión (EI) del parásito en
estudio en las ratas inducidas a infección.
Al diseccionar a los caracoles de longitud mayor
a 9 mm infectados naturalmente con F. hepatica
de ambos sectores A y B, se obtuvo cercarías,
desarrollando de éstas numerosas metacercarias,
caracterizadas por presentar una disposición
uniforme de la cubierta exterior del quiste, y una
morfología interior definida, las que fueron
seleccionadas para su inoculación en ratas (Fig.
3).
Cuatro de las ratas infectadas, iniciaron la
emisión de huevos de F. hepatica a los 51 días.
C o m o d e m o s t r a r o n l o s a n á l i s i s
coproparasitoscópicos cuantitativos cuyas
4 veces, hasta obtener sobrenadante limpio. Y
finalmente un último sedimento, que se
transfirió a tubos de ensayo graduados de 10 mL
para conocer su volumen total, y posteriormente
tomar una alícuota de 0,2 mL de este sedimento
para su lectura en un frotis con una gota de azul
de metileno al 1 % (colorante de fondo), que
resalta los huevos de F. hepatica en amarillo
dorado para contabilizarlos en toda la lámina a
400 X y estimar la emisión de huevos de F.
hepatica contenidos en el volumen total del
sedimento fecal obtenido de cada rata durante
cada uno de los 15 días de análisis.
A los 101 días post infección, se procedió con la
narcosis por inhalación de 2 mL de cloroformo
en el interior de un desecador de vidrio a cada
una de las seis ratas, procediendo luego a su
dislocación cervical. Para su tanatosis,
ubicándolas en posición cúbito ventral para
proceder con el corte en la línea medio-ventral,
hasta visualizar la cavidad abdominal, en ella el
hígado, donde el adulto de F. hepatica tiene su
microhábitat específico, realizando un
minucioso estudio in situ de este órgano para
observar si existen lesiones típicas en el
RESULTADOS
Tabla 1.Número de huevos de Fasciola hepatica emitidos por ratas infectadas, de los 86 a 100 días post-infección
experimental.
Grupo A. F. hepatica procedente
de La
Joya Grupo B. F. hepatica
procedente
de
Rumitabla
Día pos-
infección
Rata 1
Rata 2
Rata 3
Rata 1
Rata 2
Rata 3
86
0
8125
14300
4550
0
0
87
0
9250
11400
6400
1950
0
88
0
8320
27000
5220
3500
0
89
0
12880
24700
17920
19220
0
90
0
9200
33750
24180
11550
0
91
0
4180
16380
5100
10875
0
92
0
4900
50850
25200
6000
0
93
0
10500
26245
14080
2640
0
94
0
18245
46080
96600
4060
0
95
0
13860
49560
43870
4375
0
96
0
2870
46200
44000
9000
0
97
0
7770
31920
22800
11600
0
98
0
24750
32400
32760
8700
0
99
0
2880
33005
13760
46740
0
100
0
10500
32760
23180
13440
0
Promedio
0
9899,38
31816,75
25221,99
10281,90
0
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Neotrop. Helminthol., 7(2), 2013
ratas restantes (A1 y B3) de las seis inoculadas,
no mostraron adultos de F. hepatica, ni lesiones
visibles en la necropsia, coincidiendo con la no
emisión de huevos de F. hepatica en sus
escíbalos. El cálculo de extensión de la invasión
y potencia invasiva se muestran en la Tabla 3.
Se estimó en el sedimento fecal de cada rata
entre los 86 y 100 días de infección el cociente
de la media de huevos emitidos por rata/día entre
el número de adultos de F, hepatica encontrados
en necropsia de cada rata (Tabla 4), resultando
9135,70 ± 2196,8 huevos por adulto de este
digeneo.
medias se observan en la Tabla 1, durante 15 días
de análisis en los que se visualizaron huevos de
F. hepatica (Fig. 4) y en dos ratas no se halló
huevo alguno.
Al sacrificar las ratas a los 101 días post
infección (14 semanas), en los hígados de cuatro
de ellas, se confirmó adultos de F. hepatica, aún
activos en conductos hepáticos (Fig. 5)
procediéndose a su colecta, fijación y medición
(Tabla 2), confirmando también lesiones
hepáticas visibles (Fig. 6) y en una de ellas (rata
1B) era severa. La rata A2 presentó un adulto; la
A3 cuatro; la B1 tres; y la B2 uno adulto. Las dos
Tabla 3. Cálculo de Extensión de la invasión (EI) y potencia invasiva (PI) de Fasciola hepatica en Rattus norvegicus
Holtzman.
Grupo
Fasciolas
encontradas
en el hígado
Intensidad de
infección
(carga
parasitaria)
Media Extensión de
la invasión EI.
(%)
Potencia
Invasiva PI.
(%)
Grupo A
4,1,0
5
2,5 66,67 8,33
Grupo B
3,1,0
4
2 66,67 6,67
Total 9 2,25 66.67 7,5
Tabla 2. Longitud de los adultos de Fasciola hepatica hallados en conducto biliar de Rattus norvegicus Holtzman de
infección inducida.
Rata Longitud de F. hepatica (mm) Promedio
A2 15 -
- - 15
A3 7 7
8 6 7
B1 10 8
7 - 8,3
B2 14 - - - 14
Tabla 4. Cálculo del número de huevos emitidos por adulto de Fasciola hepatica en ratas infectadas con
metacercarias procedentes de la Joya (Grupo A) y Rumitabla (Grupo B).
Rata
Media de huevos emitidos por
rata/día
Número de adultos
en cada rata Número de huevos/
adulto de F. hepatica
A2
9899,38±1516,5 (2870-24750) 1 9899,38±1516,5
A3
31816,75±3207,6(11400-50850) 4 7954,19±801,9
B1
25221,99±6078,23(4550-96600) 3 8407,33±2026,07
B2
10281,90±2926,35(0-46740)
1 10281,90±2926.23
Promedio
19305,005
2,25 9135,70±2196.8
259
Iturbe-Espinoza & Muñiz-Pareja
Fasciola hepatica and its biotic potential in Rattus
Figura 1.Gomita con 20 metacercarias de Fasciola hepatica. Figura 2. Mantenimiento de ratas Holtzman infectadas con
Fasciola hepatica en bioterio.
Figura 3. Metacercarias de Fasciola hepatica obtenidas in
vitro en placa Petri, 20X. Figura 4. Huevo de Fasciola hepatica en tinción de azul de
metileno al 1 %, 400X
Figura 6. Hígado lesionado de Rattus norvegicus infectado
con Fasciola hepatica
Adulto de F.
hepatica en
conducto biliar
Figura 5. Hígado de Rattus norvegicus infectado con
Fasciola hepatica
Adulto de F.
hepatica en
conducto biliar
260
Neotrop. Helminthol., 7(2), 2013
ambos valores por debajo de los obtenidos por
Olazabal et al. (1999) pero los 21 días post-
infección, con una PI = 23% en ratas Wistar;
pues según estos autores, esta diferencia puede
deberse a la expresión de inmunidad de las ratas,
disminuyendo a partir de la séptima semana la
cantidad de parásitos en los animales infectados,
y también se debería a la diferencias de
receptividad entre razas de ratas, pudiendo ser la
Holtzman menos receptiva que la Wistar a la
infección por F. hepatica.
Al madurar F. hepatica en conductos biliares
inicia la emisión de huevos al medio externo
mediante la materia fecal de su hospedador
vertebrado, esto constituye el factor biológico
que marca la transición de la curva, es decir, el
punto que divide la fase de crecimiento
exponencial de la fase de saturación en la
dinámica de F. hepatica (Ordoñez, 2009), lo que
se estimó mediante la técnica de concentración
por sedimentación de Lumbreras en cuanto al
número de huevos por adulto de F. hepatica en R.
norvegicus es de 9135,70 ± 2196,8, dicho
cálculo está próximo del límite señalado por
Carrada (2007), quién indica que una F. hepatica
adulta pone entre 10 000 y 20 000 huevos al día.
Una relación similar entre la carga parasitaria y
la producción de huevos ha sido demostrada en
ovejas, oscilando desde una media de 25000
huevos/día/parásito adulto en infecciones leves
y hasta 8800 huevos/día/parásito adulto en
infecciones más severas (Boray, 1969).
Se concluye que a los 101 días post-infección, la
potencia invasiva en ratas Holtzman fue de 8,33
% para F. hepatica procedente de La Joya y de
6,67 % para F. hepatica procedente de
Rumitabla; la extensión de la invasión en ratas
Holtzman fue de 66,67 % para F. hepatica de
ambas procedencias, se sugiere inducir
infección de ratas con diferentes números de
metacercarias, para realizar estudios del
“crowding effect” (inhibición competitiva), y su
relación con la potencia invasiva, crecimiento y
número de huevos emitidos por parásito.
DISCUSIÓN
La emisión de huevos de F. hepatica en R.
norvegicus, especie utilizada en la presente
investigación se inició el día 51 post-infección
(7 semanas), casi coincidiendo con Prepelitchi et
al. (2003) cuyas ratas infectadas in vitro tuvieron
un periodo pre-patente de 44 – 49 días y con
Boray et al. (1984), quien en ovejas infectadas
con 200 metacercarias concluyó que el periodo
prepatente es de 63 días, mientras con
infecciones más severas (inducidas con 2000
metacercarias) los huevos aparecen a las 13-15
semanas después de la ingestión. Se infiere de
los resultados que el período prepatente, se
presenta en función del tamaño del hospedero
definitivo, siendo más temprano cuando posee
menor tamaño y viceversa, probablemente
debido a que el espacio por recorrer es más corto
para la adolescaria.
Ordoñez (2009) infectó ratas con 20
metacercarias/rata vía oral y observó que se
manifestó el “crowding effect” (inhibición
competitiva), es decir, en las últimas fases de
desarrollo del tremátodo, las tasas de
crecimiento de las medidas corporales son más
altas cuando menor es la carga parasitaria,
repercutiendo en el tamaño de los tremátodos,
pudiendo indicar que el número de huevos por g
de heces tiende a desestimar entonces la carga
parasitaria, al momento de medir la longitud de
los tremátodos durante la necropsia de las ratas
(Tabla 2), se observó que los adultos de F.
hepatica encontrados en conjunto presentan
menor tamaño en comparación de los que
parasitan el hígado individualmente.
Además también se observó diferencias en la
cantidad de huevos emitidos en confrontación a
la carga parasitaria de cada rata. De tal forma
que la cantidad de huevos/adulto parece ser
dependiente del nivel de infección,
disminuyendo la cantidad de huevos, cuando
aumenta la carga parasitaria de adultos (Tabla 4).
Presentándose una potencia invasiva para la
fasciolosis procedente de La Joya, Anta (Grupo
A) PI = 8,33% y para la fasciolosis procedente de
Rumitabla, San Jerónimo (Grupo B) PI = 6,67%,
261
Iturbe-Espinoza & Muñiz-Pareja
Fasciola hepatica and its biotic potential in Rattus
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Received April 4, 2013.
Accepted August 29, 2013.
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Correspondence to author/ Autor para
correspondencia:
Paul Iturbe-Espinoza
Facultad de Ciencias Biológicas. Centro de
Investigaciones Parasitológicas Regionales Inka-
CIPRI Universidad Nacional de San Antonio Abad
de Cusco. Av. La Cultura 733 Cusco, Perú.
E-mail / Correo electrónico:
iturbe555@hotmail.com
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