ISSN Versión impresa 2218-6425 ISSN Versión Electrónica 1995-1043
Neotropical Helminthology, 2018, 12(1), ene-jun:9-20.
ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL
STANDARDIZATION OF THE PCR TECHNIQUE FOR TOXOCARA CANIS DNA DETECTION IN
SOIL SAMPLES
ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE PCR PARA LA DETECCIÓN DE ADN DE TOXOCARA
CANIS (WARNER, 1782) EN MUESTRAS DE TIERRA
1 Instituto de Investigaciones Biomédicas “Dr. Francisco J. Triana Alonso” (BIOMED), Facultad de Ciencias de la
Salud, Universidad de Carabobo Sede Aragua, Venezuela. Tel +58-243-2425822; Fax +58-243-2425333
2 Departamento de Parasitología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo Sede Aragua,
Venezuela.
1 1 1 1
Andrés Romero-Osorio ; Angie Romero-Coronel ; María Lares-Hernández ; Emily Catalano-Donaire ;
1,2 1,2*
María Martínez-Aguilera & Elizabeth Ferrer-Jesús
ABSTRACT
Keywords: diagnosis – epidemiology – molecular techniques – toxocariasis – PCR – soil
Toxocariasis is produced mainly by the canine parasite Toxocara canis (Warner, 1782). The human is
infected by eggs from feces eliminated by dogs. Therefore, it is important to detect the existence of the
parasite in soil samples. The aim of this work was to standardize the PCR technique for the detection of T.
canis DNA in soil samples. Three DNA extraction protocols were used (salt precipitation, Chelex® 100
resin, and Promega Kit) to identify the quantity and quality of DNA were obtained from eggs, larvae and
adults of the parasite. The optimum reaction conditions of the components of the PCR (dNTP, MgCl ,
2
primers and Taq polymerase) and hybridization temperature and number of cycles of the PCR were
determined. The analytical sensitivity and specificity of the technique were also determined and the
standardized technique was used in soil samples contaminated with parasite DNA. The best DNA
extraction protocol was the Promega kit, the optimal PCR conditions were: 200 µM dNTP, 1.5 mM MgCl ,
2
0.4 µM primers, and 1 U of Taq polymerase and 35 cycles, at 55 °C. The sensitivity was 1 pg of DNA and
the specificity was 100%. Inhibition was observed, which was reversed by adding bovine serum albumin
to the reaction, achieving amplification of up to 1 pg of DNA, so that standardized PCR could be a tool
useful for epidemiological studies and control programs.
Neotropical Helminthology
9
INTRODUCCIÓN
10
RESUMEN
La toxocariasis es producida principalmente por el parásito del perro Toxocara canis (Warner, 1782). El
humano se infecta al ingerir los huevos eliminados en las heces del perro, por lo que es importante conocer
la existencia del parásito en muestras de suelo. El objetivo de este trabajo fue estandarizar una PCR para la
detección de ADN de T. canis en muestras de tierra. Se utilizaron tres protocolos de extracción de ADN
(Precipitación salina, Resina Chelex® 100 y Estuche Promega), para identificar con cual se obtenía mejor
cantidad y calidad de ADN a partir de huevos, larvas y adultos del parásito. Se determinaron las
condiciones óptimas de reacción de los componentes de la PCR (dNTP, MgCl , cebadores, y Taq
2
polimerasa), así como la temperatura de hibridación y número de ciclos. Se determinó la sensibilidad y
especificidad analíticas y se empleó la técnica estandarizada en muestras de tierra contaminadas con ADN
del parásito. El mejor protocolo de extracción fue el Estuche de Promega, las condiciones óptimas de la
PCR fueron; dNTP 200 µM, MgCl 1,5 mM, cebadores 0,4 µM, y Taq polimerasa 1 U, 35 ciclos y 55 °C
2
como temperatura de hibridación. Se obtuvo una sensibilidad de 1 pg y 100% de especificidad. Al aplicar
la PCR estandarizada en las muestras de tierra contaminadas con ADN del parásito se observó inhibición,
la cual fue revertida al añadir albúmina sérica bovina a la reacción, logrando amplificar hasta 1 pg de
ADN, por lo que la PCR estandarizada podría ser una herramienta útil para los estudios epidemiológicos y
los programas de control.
Neotropical Helminthology, 2018, 12(1), ene-jun
Palabras clave: diagnóstico – epidemiología – técnicas moleculares – toxocariasis – PCR – tierra.
fiebre, leucocitosis, eosinofília, destacando
síntomas específicos según los órganos que se
encuentre afectando el parásito (Fillaux &
Magnaval, 2013; Macpherson, 2013).
La toxocariasis es una infección cosmopolita,
endémica en la mayor parte de los países de
América, África y Asia. La infección por T. canis
en perros y en humanos tiene tasas de distribución
mundial que varían de 1,3 a 99,4%, y en América
Latina varían, de acuerdo a cifras publicadas, de
1,8 a 78% (Agudelo et al., 1990; Acero et al., 2001;
Giraldo et al., 2005; Chiodo et al., 2006; Torres &
López 2006; Espinosa et al., 2008; Rivarola et al.,
2009; Romero-Nuñez et al., 2013; Cassenote et al.,
2014).
Por otro lado, el suelo es muy importante en la
diseminación de esta parasitosis, por lo que se han
realizado estudios sobre la presencia de huevos de
Toxocara sp, mediante técnicas parasitológicas, en
plazas y parques públicos en varios países (Alonso
et al., 2006; Polo-Terán et al., 2007; Celis-Trejo et
al., 2012; Ramírez et al., 2014; Guarín-Patarroyo
et al., 2016; Astaiza-Martínez et al., 2016; Melín-
Coloma et al., 2016).
La toxocariasis humana es una zoonosis parasitaria
causada por las larvas de Toxocara canis Warner,
1782 y Toxocara cati Schrank, 1788, cuyos
hospedadores definitivos son el perro y el gato,
respectivamente. La infección se produce debido a
la ingesta de alimentos o agua contaminada con los
huevos de este parásito, o por el contacto directo
con la tierra contaminada con las heces de estos
animales infectados. Los huevos eclosionan en el
tracto intestinal y las larvas liberadas migran hacia
los diferentes órganos y tejidos del cuerpo donde se
forman granulomas (Moreira et al., 2014; Holland,
2017).
Toxocara canis puede producir el Síndrome de
Larva Migrans Visceral (SLMV), en el cuál las
larvas liberadas en el intestino migran hasta llegar a
diversos órganos como hígado, pulmones, sistema
nervioso central, riñón y miocardio. Cuando las
larvas llegan al globo ocular se produce el
Síndrome de Larva Migrans Ocular (SLMO), en el
que las larvas pueden dañar la retina y afectan la
visión. Los signos y síntomas principales de la
toxocariasis se caracterizan generalmente por
Romero-Osorio et al.
En Venezuela no se conoce la prevalencia general
de la infección, en algunos estudios en varias zonas
del país, se han encontrado seroprevalencias entre
el 9,7 y 66,6%, en algunas comunidades de
diversos estados (Lynch et al., 1988; Pifano et al.,
1989; García-Pedrique et al., 2004; Díaz-Suárez et
al., 2010; Martínez et al., 2015; Devera et al.,
2015a; Cermeño et al., 2016).
Por otro lado, mediante técnicas parasitológicas se
han identificado huevos de Toxocara spp. en plazas
y parques públicos de ciertas zonas de algunos
estados, encontrándose porcentajes de infección
entre 25 y 100% (Cazorla et al., 2007; Devera et al.,
2008; Apóstol et al., 2013; Devera et al., 2014;
Devera et al., 2015b; Gallardo & Forlano, 2015;
Javitt-Jiménez et al., 2016).
El diagnóstico molecular utilizando la Reacción en
Cadena de la Polimerasa, PCR (por sus siglas en
inglés Polymerase Chain Reaction), permite
determinar ADN del parásito en muestras de heces
de perros y en suelos, y podría ser una ventaja sobre
las técnicas coprológicas ya que la detección de
huevos en tierra no es muy sensible, debido a
huevos rotos o deteriorados y no fácilmente
identificables (Fillaux & Magnaval, 2013; Moreira
et al., 2014). En otros países se ha utilizado la
técnica de PCR para detección de ADN de T. canis
y T. cati en muestras de tierra, permitiendo
identificar las zonas donde está circulando el
parásito; además de permitir la diferenciación del
ADN de T. canis, del de T. cati, lo cual no puede
hacerse por técnicas parasitológicas, ya que los
huevos son indistinguibles (Fogt-Wyrwas et al.,
2007; Borecka & Gawor, 2008; Khademvatan et
al., 2014).
Es por ello que el objetivo de este trabajo fue la
estandarización de una técnica de PCR para
detectar ADN de T. canis en muestras de tierra, y así
disponer de una herramienta que pueda ser
utilizada en estudios epidemiológicos y ayudar a
los programas de control.
Muestras biológicas
Se utilizaron muestras de huevos, larvas y adultos
de T. canis, obtenidos por desparasitación de
MATERIALES Y MÉTODOS
11
cachorros (Nieves et al., 2012) para la extracción
de ADN. El ADN extraído se usó como control en
las reacciones de estandarización, evaluación de la
sensibilidad de la PCR, y en la contaminación de
las muestras de tierra. Para la determinación de la
especificidad de la PCR se utilizaron muestras de
ADN humano, canino y de diferentes parásitos;
Ascaris lumbricoides (Linneo, 1758), Enterobius
vermicularis (Linneo, 1758), Necator americanus
(Stiles, 1902), Schistosoma mansoni (Bilharz,
1851), Fasciola hepatica (Linneo, 1758) y Taenia
solium (Bonomo, 1687). Además, se tomaron
muestras de tierra de jardineras y macetas de
apartamentos sin perros, ni gatos, para asegurar que
no tenían la posibilidad de estar infectadas con
Toxocara spp. A partir de allí se prepararon 6
muestras de 0,5 g cada una, a las cuales se les
añadieron cantidades decrecientes de ADN del
parásito, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg y 1 pg.
Técnicas de extracción de ADN
Para la extracción de ADN a partir de huevos,
larvas y adultos del parásito, se utilizaron; la
técnica de precipitación salina (Sambroock &
Russell, 2001), el uso de resina Chelex®100
(BioRad, USA) y el estuche comercial
Wizard®Genomic DNA purification Kit (Promega,
USA) a fin de lograr un procedimiento de
extracción adecuado que permitiera la
amplificación de la secuencia ITS-2 de T. canis.
Protocolo de extracción de ADN por la técnica
de precipitación salina
La extracción por la técnica de precipitación salina,
se realizó siguiendo el protocolo descrito por
Sambroock & Russell (2001). Se colocó una
cantidad de huevos, larvas o adultos de
aproximadamente 50 mg en un tubo de 1,5 mL. Se
añadió 500 µL de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM
pH 8, EDTA 10 mM pH 8, SDS 1%) y se mezcló. Se
agregó 2,5 µL de ARNasa (10 mg/mL) y se incubó
30 min a 37 °C. Se añadió 2,5 µL de Proteinasa K
(Pierce, USA) (20 mg/mL) e incubó a 55 °C por 4 h.
Posteriormente, se centrifugó a 14.000 rpm por 30
min y se trasvasó el sobrenadante. Se añadió 2
volúmenes de etanol (95%) frío y 1/10 de volumen
de acetato de sodio 3 M pH 7. Se mezcló e incubó
30 min a -20 °C. Se centrifugó a 14.000 rpm por 15
min, y se removió el etanol para luego lavar el
precipitado con 1 mL de etanol al 70%. Se
centrifugó a 14.000 rpm por 15 min y se removió el
etanol. Se dejó secar y resuspendió el ADN en 50
Neotropical Helminthology, 2018, 12(1), ene-jun PCR technique for Toxocara canis
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µL de agua destilada. Las muestras de ADN se
mantuvieron a -20 °C hasta su uso.
Protocolo para la extracción de ADN por la
técnica de Chelex®100-Proteinasa K.
La extracción usando la resina Chelex®100
(BioRad, USA), se llevó a cabo siguiendo las
instrucciones del fabricante. Se colocó una
cantidad, huevos, larvas o adultos de
aproximadamente 50 mg en un tubo de 1,5 mL. Se
añadió 500 µL de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM
pH 8, EDTA 10 mM pH 8, SDS 1%), 200 µL de
Chelex-100® (BioRad, USA) al 5% y 2,5 µL de
-1
proteinasa K (Pierce, USA) (20 mg·mL ), se
mezcló e incubó por 30 min a 60 °C.
Posteriormente se incubó a 100 °C por 10 min. Se
centrifugó durante 5 min a 14.000 rpm y se separó
el sobrenadante que contenía el ADN. Las muestras
se mantuvieron a -20 °C hasta su uso.
Protocolo para la extracción de ADN con el
estuche de Promega (Wizard®Genomic DNA
purification kit).
La extracción de ADN usando el estuche
Wirard®Genomic DNA purification kit (Promega,
USA), se realizó siguiendo las instrucciones del
fabricante. Las muestras del parásito fueron
previamente maceradas con nitrógeno líquido. Se
lavó 0,5 g de material parasitario o de tierra con 500
µL de agua destilada en un tubo de 1,5 mL, y se
centrifugó por 5 min a 14.000 rpm. Se colectó el
sobrenadante y se evaporó el líquido en el DNA
Speed Vac 120 (Savant, USA) hasta 100 µL. Se
añadió 50 µL de solución de lisis. Se mezcló e
incubó 30 min a 60 °C. Se dejó a temperatura
ambiente y se añadió 100 µL de solución de
precipitación de proteínas. Se mezcló e incubó 15
min en hielo. Luego se centrifugó durante 5 min a
14.000 rpm, se trasvasó el sobrenadante, se añadió
800 µL de isopropanol y se mezcló e incubó 15
minutos a temperatura ambiente. Se centrifugó
durante 5 min a 14.000 rpm y se descartó el
sobrenadante. Se lavó con 800 µL de etanol al 70%
y se centrifugó durante 3 min a 14.000 rpm. Se
descartó el etanol y se dejó secar completamente.
Se resuspendió el ADN con 25 µL de agua destilada
estéril y se almacenó a -20 °C hasta su uso.
Medida de la concentración, pureza e
integridad del ADN
La concentración y pureza del ADN extraído
fueron determinadas por los métodos descritos por
Sambrook & Russell (2001). La concentración de
ADN fue medida en un espectrofotómetro
UV/Visible Ultrospec 3000 (Pharmacia Biotech,
USA) midiendo la densidad óptica a 280 y 260 nm,
usando la siguiente fórmula: [ADN]= A × D
260nm
-1
(factor de dilución) × 50 µg·mL . El grado de
pureza fue calculado mediante la relación
A /A y su integridad fue evaluada por
260nm 280nm
electroforesis.
Electroforesis de ADN
La electroforesis de ADN fue realizada de acuerdo
con el procedimiento descrito por Sambrook &
Russell (2001), en geles de agarosa al 1 %, usando
el tampón Tris-Acetato-EDTA (TAE) (Tris-acetato
40 mM, EDTA 1 mM, pH 8) y un sistema de
electroforesis horizontal MINICELL® Primo EC
320 de TDI (Thermo, USA). El voltaje usado fue de
60-100V, de acuerdo con el tamaño del gel. Los
geles fueron teñidos con bromuro de etidio (0,5
μg/mL). Las bandas de ADN fueron visualizadas
con luz UV usando el sistema Gel Doc®1000
(BioRad, USA) El tamaño de las bandas de ADN
fue determinado, comparándolas con las de los
marcadores de ADN, de 1 Kb para el ADN
genómico y de 100 pares de bases (pb) (Promega,
USA) para las amplificaciones por PCR.
Estandarización de la PCR para la detección de
la secuencia ITS-2 de T. canis
La PCR para la amplificación de la secuencia del
espaciador intergénico 2 (ITS-2, del inglés,
Intergenic Transcribed Spacer), del ADN
ribosomal de T. canis fue realizada, usando
muestras de ADN extraídas de huevos, larvas y
adultos de T. canis. Las reacciones de
amplificación fueron realizadas de acuerdo al
protocolo descrito por Borecka & Gawor (2008),
empleando los cebadores; directo, Tcan1
5´AGTATGATGGGCGCGCCAAT-3´ y el
reverso, NC2 5´- TAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3´
(Sigma, USA), variando las concentraciones de los
diferentes reactivos (dNTPs, cloruro de magnesio,
cebadores y ADN polimerasa), y las condiciones de
temperatura de hibridación y número de ciclos para
obtener el producto de PCR esperado de 380 pb de
T. canis. Para la estandarización de la técnica se
variaron las siguientes condiciones:
Cantidad de ADN molde: Desde 100 nanogramos
(ng) hasta 1 picogramo (g). Se hizo la curva
utilizando las cantidades de ADN de 100 ng, 10 ng,
1 ng, 100 pg, 10 pg y 1 pg.
Neotropical Helminthology, 2018, 12(1), ene-jun Romero-Osorio et al.
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Concentración de los diferentes reactivos:
Desoxinucleótidos tri-fosfato (dNTPs) (Promega,
USA) (100 µM, 150 µM, 200 µM y 250 µM),
Cloruro de Magnesio (Mg Cl) (Promega, USA) (1
2
mM, 1,5 mM, 2 mM y 2,5 mM), Cebadores (0,2
μM, 0,4 μM, 0,6 μM y 0,8 μM), Taq ADN
polimerasa (Promega, USA) (0,5 U, 0,75 U, 1 U y
1,25 U).
Programa de amplificación (temperatura de
hibridación y número de ciclos):
L a s c o n d i c i o n e s e n s a y a d a s f u e r o n :
desnaturalización inicial a 95 ºC por 5 min, y
30/35 /40 cicl os de los procesos d e:
desnaturalización (94 °C, 1 min), hibridación
(50/55/60 °C, 1 min) y extensión (72° C, 1 min).
Adicionalmente se realizó una extensión final a
72ºC por 5 min. Se realizó la PCR en un
termociclador C1000 Thermal Cycler (BioRad,
USA), cada amplificación incluyó un control
negativo libre de ADN y un control positivo (ADN
del parásito). Los productos de PCR fueron
visualizados en geles de agarosa al 1 % y
comparados con marcadores de tamaño molecular.
Determinación de la sensibilidad analítica y la
especificidad de la PCR
La sensibilidad se determinó haciendo curvas de
titulación con diferentes cantidades de ADN (100
ng a 1 pg), para observar cual es la menor cantidad
de ADN que producía amplificación. La
especificidad se determinó utilizando ADN
humano, canino y de diferentes parásitos (A.
lumbricoides, E. vermicularis, N. americanus, S.
mansoni, F. hepatica y T. solium).
Análisis de resultados
Se compararon todas las condiciones ensayadas
para la técnica de PCR, y se seleccionaron como
óptimas, aquellas condiciones donde se observaron
bandas del tamaño esperado, únicas, nítidas y con
ausencia de productos secundarios a través de
imágenes fotográficas de los geles.
Técnicas de extracción de ADN
Se utilizaron tres protocolos para la extracción de
ADN a partir de huevos, larvas y adultos del
parásito. Tanto en la técnica de precipitación salina,
como de Chelex®100, se obtuvo un rendimiento
bajo de ADN y un grado de pureza por debajo del
rango óptimo. Con respecto a la integridad del
ADN no se observaron bandas nítidas (solo un
tenue “barrido”) en ninguna de las extracciones
realizadas por estas técnicas con las diferentes
muestras (huevos, larvas y adultos de T. canis). Se
trató de utilizar, estas muestras de ADN para la
realización de la técnica de PCR, pero no se obtuvo
amplificación en ninguna de las muestras (Datos
no mostrados).
Para el protocolo del estuche de Promega se realizó
la maceración de las muestras del parásito con
nitrógeno líquido, y se observó mayor rendimiento
y pureza del ADN extraído, además de mejores
resultados en integridad (Datos no mostrados). Por
disponer de mayor cantidad y calidad de ADN
extraído a partir de las muestras de adultos del
parásito, se utilizaron muestras de ADN de adultos,
extraídas por esta técnica, como controles positivos
para realizar la estandarización de la PCR y la
contaminación de las muestras de tierra. Por otro
lado, se utilizó este protocolo para la extracción de
ADN a partir de las muestras de tierra
contaminadas, por ser el que proporcionó mejor
cantidad y calidad de ADN.
Estandarización de la Técnica de PCR
En la evaluación de los desoxinucleotidos tri-
fosfato (dNTPs) resultó ser la concentración
óptima la de 200 µM en la cual se observó una
mejor amplificación, ya que en las otras
concentraciones las bandas se observan más tenues
(producto de amplificación del ADN esperado de
380 pb) (Fig. 1a). Con respecto a la concentración
del cloruro de magnesio (MgCl ) resultó ser la
2
concentración óptima, 1,5 µM (Fig. 1b). En cuanto
a la concentración de los cebadores resultó la
concentración adecuada para obtener una buena
amplificación la de 0,4 µM, al observarse mejores
bandas de amplificación (Fig. 1c). En la evaluación
de las diferentes concentraciones de la enzima Taq
polimerasa 1U fue la concentración óptima (Fig.
1d). Por otra parte, se realizó la evaluación de la
temperatura de hibridación, donde se observó que
la temperatura óptima fue de 55°C ya que se obtuvo
una mejor amplificación en comparación a
temperaturas de 50°C y 60°C (Fig. 2a). Por último,
en cuanto a la evaluación del número de ciclos se
determinó que 35 ciclos, era el número de ciclos
óptimo (Fig. 2b).
RESULTADOS
Neotropical Helminthology, 2018, 12(1), ene-jun PCR technique for Toxocara canis
14
Determinación de la sensibilidad y especificidad
de la técnica de PCR estandarizada
En el gel de agarosa se logró observar que hubo
amplificación de ADN en un rango de
concentraciones desde 100 ng hasta 1 ρg, siendo así
la sensibilidad analítica de la técnica de 1 ρg (Fig.
2c). Por otra parte, en cuanto a la especificidad,
solo hubo amplificación en la muestra de ADN de
T. canis, demostrando una especificidad del 100%
(Fig. 2d).
Detección de ADN de T. canis en muestras de
ti e r r a m edi a n t e l a té c n i c a de P C R
estandarizada
En principio, no se observó amplificación de ADN,
en ninguna de las muestras de tierra contaminada
con el ADN del parásito (Datos no mostrados). Se
pensó que podría existir la presencia de inhibidores
de la PCR en dichas muestras, por lo que se
procedió a utilizar albumina de suero bovino (BSA,
del inglés Bovine Serum Albumin) en la reacción de
PCR, la cual es utilizada frecuentemente para
evitar la inhibición causada por el ácido húmico
presente en la tierra.
Neotropical Helminthology, 2018, 12(1), ene-jun Romero-Osorio et al.
Figura 1. Amplificación de ADN de T. canis en diversas muestras. (M) Marcador de tamaño molecular
100 pb plus DNA ladder, Promega. (a) Temperatura de hibridación (b) Número de ciclos. (C+1) Control
positivo 1 ADN de T. canis. (C+2) Control positivo 2 ADN de T. canis. (C-1) Control negativo 1. (C-2)
Control negativo 2. (c) Sensibilidad analítica de la técnica de PCR. 1-6: Concentración de ADN. 100 ng,
10 ng, 1 ng, 100 ρg, 10 ρg, 1 ρg, respectivamente 7 control negativo. (d) Especificidad de la técnica de
PCR usando muestras de ADN de diferentes fuentes (1) T. canis, (2) A. lumbricoides, (3) E. vermicularis,
(4) N. americanus, (5) S. mansoni, (6) F. hepatica, (7) T. solium, (8) Humano, (9) Canino, (10) Control
negativo. (e) amplificación de ADN de T. canis de muestras de tierras contaminadas tratada con diferentes
concentraciones de BSA. 1-6: Muestras de ADN (100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 ρg, 10 ρg, 1 ρg) tratadas con 1µg
de BSA. (7) Control negativo. 8-13: Muestras de ADN (100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg) tratadas
con 2 µg de BSA. 14: Control negativo.
15
Neotropical Helminthology, 2018, 12(1), ene-jun PCR technique for Toxocara canis
Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la amplificación de ADN de T. canis en muestras controles, variando las
concentraciones de los diferentes reactivos. (M) Marcador de tamaño molecular 100 pb plus DNA ladder, Promega. (a) dNTPs,
(b) MgCl (c) Cebadores, (d) Taq polimerasa. (C+1) Control positivo 1 ADN de T. canis. (C+2) Control positivo 2 ADN de T.
2,
canis. (C-1) Control negativo 1. (C-2) Control negativo 2.
Se repitió el ensayo agregando diferentes
cantidades de BSA al ADN extraído (1 µg BSA y 2
µg BSA) obteniendo una buena amplificación en
todas las muestras para ambos casos, pero bandas
más definidas con concentración de BSA de 1µg,
pudiendo así amplificar hasta 1pg del ADN
extraído de estas muestras de tierra contaminadas,
logrando obtener el producto de PCR esperado de
380 pb de T. canis en dichas muestras (Fig. 2e).
El aislamiento de ADN de alta calidad es esencial
para la técnica de PCR y en esta se requiere una
previa estandarización, adaptación y evaluación de
las condiciones de reacción para su uso en cada
laboratorio. A nivel internacional, se ha empleado
la técnica de PCR para determinar ADN de T. canis
en muestras de tierra, por ofrecer alta sensibilidad y
especificidad, además de ser un marcador de
endemicidad al determinar las áreas donde está
circulado el parásito (Fogt-Wyrwas et al., 2007;
Borecka & Gawor, 2008; Khademvatan et al.,
2014).
En cuanto a las extracciones de ADN a partir de
huevos, larvas y adultos de T. canis mediante la
técnica de precipitación salina y la técnica de
extracción Chelex®100 (BioRad) ninguna de las
dos técnicas mostró los resultados deseados, ya que
se observaba, poco rendimiento, baja pureza y
degradación del ADN, lo que no permitió la
amplificación de la banda diagnóstica. Mientras
que al utilizar el estuche comercial de Promega el
rendimiento, la pureza y la integridad resultaron
mejores, permitiendo la amplificación del ADN del
parásito. Esta diferencia quizás se deba, al paso
previo (recomendado en el estuche comercial) de
trituración del material parasitario en nitrógeno
líquido que permite una mejor extracción de ADN
de la muestra. Sería recomendable emplear este
paso previo en los otros protocolos de extracción
ensayados, ya que el uso de estuches comerciales
tiene como desventaja que son de mayor costo. En
la mayoría de los trabajos publicados se utilizaron
estuches comerciales para la extracción de ADN y
no refieren tener problemas con el ADN obtenido
(Fogt-Wyrwas et al., 2007; Li et al., 2007; Borecka
& Gawor, 2008; Mikaeili et a l ., 2013;
Khademvatan et al., 2014).
Con todas las muestras de ADN extraídas por los
diferentes protocolos se realizó la técnica de PCR
bajo las condiciones de Borecka & Gawor (2008).
Sin embargo, solo se logró obtener amplificación,
con el ADN obtenido por el estuche de Promega,
por lo que fue el que se utilizó para el resto del
trabajo.
En la estandarización de la técnica de PCR, se
16
DISCUSIÓN variaron las concentraciones de los diferentes
reactivos, temperaturas de hibridación y números
de ciclos, ya que las condiciones de reacción,
marcas de los reactivos y equipos varían en cada
laboratorio (Fogt-Wyrwas et al., 2007; Li et al.,
2007; Borecka & Gawor, 2008; Mikaeili et al.,
2013; Khademvatan et al., 2014).
En cuanto a la concentración de dNTPs se encontró
como óptima 200 µM que se corresponde con la
utilizada por Fogt-Wyrwas et al. (2007) y Mikaeili
et al. (2013), mientras que la empleada por Li et al.
(2007), Borecka & Gawor (2008) y Khademvatan
et al. (2013) fue de 250 µM, siendo una
concentración mayor que la utilizada en el trabajo
realizado.
La concentración de MgCl óptima determinada
2
fue de 1,5 mM, la misma utilizada por Fogt-
Wyrwas et al. (2007), Mikaeili et al. (2013),
mientras que Li et al. (2007), Borecka & Gawor,
(2008) y Khademvatan et al. (2013) fue de 3 mM,
mayor a la determinada en el presente trabajo.
Por otra parte, la concentración de Taq polimerasa
utilizadas por Li et al. (2007), Borecka & Gawor,
(2008) y Khademvatan et al. (2013) fue de 2 U,
mientras que Mikaeili et al. (2013) utilizaron 1,25
U siendo concentraciones mayores a las utilizadas
por Fogt-Wyrwas et al. (2007) y la técnica
estandarizada en el presente trabajo que fue de 1 U.
En cuanto a la concentración de cebadores en
nuestro trabajo se obtuvo como óptima 0,4 µM,
menor que la empleada por Fogt-Wyrwas et al.
(2007) (1 µM), Li et al. (2007) y Borecka & Gawor,
(2008) (2 µM), Mikaeili et al. (2013) (2,5 µM), y
Khademvatan et al. (2013) (10 µM).
En general todas las concentraciones óptimas de
los diferentes componentes de la PCR fueron
similares o menores que las empleadas en los otros
trabajos descritos lo que permite un ahorro de
reactivos disminuyendo el costo de la técnica.
En el caso de la temperaturas de hibridación
utilizada por Khademvatan et al. (2013) fue de 58
°C, a diferencia de la técnica estandarizada en
donde se utilizó 55 °C. Por otro lado, con respecto
al número de ciclos se encontró que no hubo
variación entre los utilizados por Li et al. (2007),
Khademvatan et al. (2013) y Mikaeili et al. (2013)
Neotropical Helminthology, 2018, 12(1), ene-jun Romero-Osorio et al.
17
y el empleado en nuestro trabajo el cual fue de 35
ciclos. Mientras que Borecka & Gawor (2008) y
Fogt-Wyrwas et al. (2007) utilizaron 30 ciclos.
En la amplificación de ADN de T. canis, se obtuvo
un rango de amplificación que va desde 100 ng
(nanogramos) hasta 1 ρg (picogramo), indicando
que la mínima cantidad de ADN que se amplifica
mediante la técnica de PCR es de 1 ρg, lo que
significa que la técnica posee una alta sensibilidad.
Así mismo, al amplificar ADN de T. canis extraído
de muestras de tierra se mantiene la sensibilidad
analítica de 1 ρg. En el trabajo realizado por Li et al.
(2007), se obtuvo una sensibilidad de 100 ng.
Además, en los trabajos realizados por Borecka &
Gawor (2008) y Khademvatan et al. (2013), la
sensibilidad fue de 10 ng. Comparando estos
resultados los cuales tienen una sensibilidad entre
10 – 100 ng, con la sensibilidad establecida en el
trabajo realizado, que fue de 1 ρg, se observa que la
técnica de PCR estandarizada en el presente trabajo
es de 10.000 a 100.000 veces más sensible. Cabe
destacar que un huevo de T. canis posee
aproximadamente 10 ρg de ADN (Maizels et al.,
2007) por lo que la técnica estandarizada estaría en
la capacidad de detectar el equivalente a la décima
parte de un huevo del parásito, obteniendo una
mejor sensibilidad que la establecida en el estudio
de Fogt-Wyrwas et al. (2007), que era capaz de
detectar el equivalente a un huevo del parásito.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo
también demuestran que la técnica de PCR para la
amplificación de ADN de T. canis, es específica, al
no amplificar ADN de otros parásitos ni ADN
canino o humano al igual que lo demostrado por
otros investigadores (Fogt-Wyrwas et al., 2007; Li
et al., 2007; Borecka & Gawor, 2008; Mikaeili et
al., 2013; Khademvatan et al., 2014).
Al utilizar muestras de tierra contaminadas con
ADN del parásito, en principio, no se observó
amplificación, quizás debido a la presencia de
inhibidores de la PCR en las muestras de tierra.
Según estudios, el principal inhibidor presente en
la tierra es una mezcla de polifenoles complejos
producidos durante la descomposición de la
materia orgánica conocidos como ácido húmico,
que actúa formando complejos con iones de hierro,
calcio y magnesio, lo que significa que podrían
quelar los iones de magnesio necesarios para el
funcionamiento de la Taq polimerasa (Kreader,
1996; Garland et al., 2010; Sidstedt et al., 2015). Se
ha demostrado que al incluir en la mezcla de PCR,
BSA se revierte la inhibición (Kreader, 1996;
Garland et al., 2010). Al emplear BSA en las
reacciones de PCR se observó amplificación en
todos los casos, revertiendo de esta manera la
inhibición. Cabe destacar que el hecho de que las
bandas de algunas de las muestras tratadas con 1 µg
de BSA no se observen de manera decreciente
podría corresponderse al hecho de que las
extracciones de ADN fueron realizadas a partir de
diferentes muestras de tierra y en cada una de ella
puede haber diferentes concentraciones de ácido
húmico.
Hasta la fecha no se tienen reportes publicados del
uso de la PCR para la detección de ADN de T. canis
en muestras de tierra en Latinoamérica, solo hay un
trabajo realizado en Colombia, donde se aislaron
los huevos del parásito de las muestras de tierra de
un parque público (por técnicas parasitológicas) y a
partir de estos huevos se realizó la extracción de
ADN y la PCR para identificar T. canis (Mendoza-
Meza et al., 2015). Aplicado la técnica de PCR
directamente a las muestras de tierra se podría
obtener una mayor sensibilidad, ya que se puede
identificar no solo huevos intactos, si no también
trazas de ADN libre, debido a huevos rotos o
det e r i ora d o s en l a ti e r r a, a d e más d e l
correspondiente ahorro de tiempo y recursos.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo
demuestran que la PCR estandarizada es altamente
sensible y específica y puede ser usada para la
amplificación de ADN de T. canis en muestras de
tierra, lo cual pudiese ser útil para estudios
epidemiológicos y para los programas de control.
Este trabajo fue financiado por los Proyectos
DIPISA-PG-2017-004 y DIPISA-PG-2017-005,
Universidad de Carabobo, Venezuela.
AGRADECIMIENTOS
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