ISSN Versión impresa 2218-6425 ISSN Versión Electrónica 1995-1043
Neotropical Helminthology, 2020, 14(1), ene-jun:35-47.
ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL
STANDARDIZATION AND VALIDATION OF THE WILLIS PARASITOLOGICAL TECHNIQUE FOR
THE DETECTION OF GEOHELMINTHS EGGS IN BEACH SAND SAMPLES
ESTANDARIZACIÓN Y VALIDACIÓN DE LA TÉCNICA PARASITOLÓGICA WILLIS PARA LA
DETECCIÓN DE HUEVOS DE GEOHELMINTOS EN MUESTRAS DE ARENA DE PLAYA
1Prácticas Profesionales de Parasitología, Departamento de Estudios Clínicos, Escuela de Bioanálisis. Facultad de Ciencias de
la Salud. Universidad de Carabobo Sede Carabobo, Venezuela.
2Instituto de Investigaciones Biomédicas “Dr. Francisco J. Triana Alonso” (BIOMED) y Departamento de Parasitología,
Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo Sede Aragua, Venezuela.
3Departamento de Parasitología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo Sede Carabobo, Venezuela.
*Corresponding author: elizabeth.ferrer@gmail.com
1,2 3
Arli Guerrero-De Abreu ; Jhon Jesús-Arzapalo ;
3 2
Doménica Carolina Cannova-González & Elizabeth Ferrer-Jesús
ABSTRACT
Keywords: Beach – geohelminths – parasites – sand – Willis technique – zoonosis
The identification of geohelminths in the environment allows the evaluation of levels of fecal
contamination and the risk of parasitic transmission. The objective of the present work was to standardize
and validate the Willis parasitological technique for the detection of geohelminth eggs (e) in beach sand
samples. One g, 5 g and 10 g of sterile sand were contaminated with a suspension of hookworms eggs in
-1 -1 -1
0.85% Saline Solution (SS) at three different concentrations (100 e·g sand, 200 e·g sand, 400 e·g sand).
The validation was carried out with a suspension of eggs of Ascaris lumbricoides (Linnaeus, 1758),
-1 -
Trichuris trichiura (Linnaeus, 1771) and Hookworms in SS, at the concentrations of 400 e·g and 800 e·g
1 as well as a sampling in Playa Blanca, Carabobo state and the Caño Pendare amerindians community in
Cedeño municipality, Bolívar state, Venezuela. The optimal working conditions were 10 g of sand
-1
contaminated with a concentration of 400 e·g (p = 0.00), with significant differences between variations
in suspension concentration (p = 0.00), but not between the series of contaminated sand (p = 0.63),
demonstrating that the parasitic concentration is directly proportional to the number of eggs recovered (r =
0.82, p = 0.00). In the validation, it was demonstrated that the percentage of recovery varies according to
the species, the eggs of hookworms showed greater recovery. Although there were no parasitic forms
during the sampling of Playa Blanca, the presence of A. lumbricoides eggs was detected in 18.5% of the
soil samples from the Caño Pendare community, demonstrating the effectiveness of the standardized
technique of Willis in soil samples.
Neotropical Helminthology
35
Volume14,Number1(jan-jun2020)
ÓrganooficialdelaAsociaciónPeruanadeHelmintologíaeInvertebradosAfines(APHIA)
Lima-Perú
VersiónImpresa:ISSN2218-6425VersiónElectrónica:ISSN1995-1043
Auspiciado por:
doi:10.24039/rnh2020141612
36
RESUMEN
La identificación de geohelmintos en el medio ambiente permite evaluar los niveles de contaminación
fecal y el riesgo de trasmisión parasitaria. El objetivo del presente trabajo fue estandarizar y validar la
técnica parasitológica Willis para la detección de huevos (h) de geohelmintos en muestras de arena de
playa. Se contaminaron 1 g, 5 g y 10 g de arena con una suspensión de huevos de Anquilostomideos en
-1 -1
Solución Salina Fisiológica 0,85% (SSF) a tres concentraciones distintas (100 h·g arena, 200 h·g arena,
-1
400 h·g arena), se aplicó la técnica de Willis con solución de NaCl 33% p/v y se contaron los huevos
recuperados. La validación se realizó con una suspensión de huevos de Ascaris lumbricoides (Linnaeus,
-1
1758), Trichuris trichiura (Linnaeus, 1771) y Anquilostomideos en SSF, a concentraciones de 400 h·g y
-1
800 h·g así como un muestreo en Playa Blanca edo. Carabobo y en una comunidad indígena Caño
Pendare, edo. Bolívar. Las condiciones óptimas de trabajo fueron 10 g de arena contaminadas a una
-1
concentración de 400 h·g (p =0,00), con diferencias significativas entre variaciones de concentración de
la suspensión (p = 0,00) no así, entre las serie de arena contaminadas (p = 0,63), demostrando que la
concentración parasitaria guarda relación directamente proporcional al número de huevos recuperados
(r=0,82; p = 0,00). En la validación se demostró que el porcentaje de recuperación varía en función a la
especie, siendo los huevos de Anquilostomideos los de mayor recuperación. Aun cuando, no se
evidenciaron formas parasitarias durante el muestreo de Playa Blanca, se detectó la presencia de huevos
de A. lumbricoides en 18,5% de las muestras de suelo de la comunidad Caño Pendare, demostrando la
efectividad de la técnica estandarizada de Willis en muestras de suelo.
Palabras clave: Arena – geohelmintos – parásitos – playa – técnica Willis – zoonosis
Las parasitosis son problemas de salud pública a
nivel mundial donde aproximadamente 1500 mill
de personas, casi el 24% de la población mundial,
está infectada por geohelmintos, estimándose que
una de cada tres personas está infectada por estos
parásitos y cerca 46 mill de niños entre 1 y 14 años
están en riesgo de infectarse (OMS, 2019). En la
última década se ha optado por evaluar la
parasitosis ambiental en zonas de alta densidad de
población humana y animal, tales como parques
urbanos, plazas públicas, playas, zonas de
recreación, en escuelas y paseos públicos en
localidades urbanas, suburbanas y rurales (de
Oliveira et al., 2011); proporcionando información
útil acerca de la magnitud del problema de salud
pública, y establecer prioridades en las zonas
geográficas de mayor riesgo de contaminación
para el control enfermedades parasitarias y
reducción de su prevalencia (Ziegelbauer et al.,
2012).
INTRODUCCIÓN
Por ende, países como Estados Unidos y Brasil, a
través de la Agencia de Protección Ambiental de
Estados Unidos, USEPA, (2000) y el Consejo
Nacional del Medio Ambiente en Brasil
(CONAMA, 2002); respectivamente, estipulan un
monitoreo periódico de las condiciones de calidad
sanitarias de arena de costa, así como del agua de
mar para la clasificación de un balneario como apto
o no para actividades de recreación. En la
República Bolivariana de Venezuela no existe
marco legal ni normativa nacional que contemple
la detección de posibles parásitos contaminantes
para el humano en la arena de playa ni agua de mar
lo que constituye un factor de mayor exposición
para infecciones (MPPPA, 2002, 2006). Sin
embargo, se ha demostrado la presencia de formas
parasitarias en arena de playa (Guerrero et al.,
2014; Guerrero et al., 2015) que expone una fuente
de infección importante para la población
venezolana.
Existen muchas variables que pueden influir en la
recuperación de formas parasitarias en muestras de
Neotropical Helminthology, 2020, 14(1), ene-jun Guerrero-De Abreu et al.
tierra, entre las que se encuentran las características
y composición del suelo (composición
fisicoquímica, granulométrica, porcentaje de
humedad, temperatura y pH) (Cazorla et al., 2007;
Hassan & Oyebamiji, 2018), condiciones
ambientales (longitud, latitud, sombreado,
localización geográfica) (Montalvo-Sabino et al.,
2014), sanitarias (densidad poblacional canina y
humana, presencia de materia orgánica fecal, entre
otras) así como el procedimiento para la
recolección de muestras de suelo tales como
profundidad (Cáceres et al., 2004), extensión de
terreno muestreado, hora de muestreo y diseño del
muestreo (Milano & Oscherov, 2002; Devera et al.,
2008; Cavalcante & Gagliani, 2011; de Oliveira et
al., 2011; Guerrero et al., 2014). Es igualmente
importante considerar las interacciones entre la
textura del suelo, la estructura de flotación y las
soluciones empleadas en la técnica (Nunes et al.,
1994; Oge & Oge, 2000; Mandarino-Pereira et al.,
2010; Tavalla et al., 2012), por ende los resultados
de las investigaciones de parásitos en suelos han
sido muy variables, incluso utilizando una misma
técnica (Bojanich et al., 2015).
La técnica de Willis (Willis, 1921) es una de las más
antiguas en coprodiagnóstico, fundamentada en el
principio de flotación simple de huevos de
helmintos con densidad inferior a 1200, y que no
requiere de mayores equipamientos (Pérez & Raña,
2016). A partir de ésta se han derivado muchas
modificaciones procedimentales (Cazorla et al.,
2007; Devera et al., 2015; Pérez & Raña, 2016)
para adaptarla particularmente al procesamiento de
muestras de tierra.
Se denota la necesidad de estandarizar y validar la
técnica parasitológica de Willis para la
recuperación de huevos de helmintos en muestras
de arena de playa, que permita su recomendación
para posteriores investigaciones de frecuencia
parasitaria en suelos de playas con gran
transitabilidad de personas susceptibles, para
identificar las zonas de riesgo, por lo que se planteó
como objetivo estandarizar la técnica
parasitológica de Willis para la detección de
huevos de geohelmintos en muestras de arena de
playa y validar la técnica con muestras de arena
contaminada experimentalmente con diferentes
especies y cantidades de huevos de helmintos, así
como con muestras de suelo de Playa Blanca del
Municipio Puerto Cabello edo. Carabobo y de la
comunidad indígena Caño Pendare, edo Bolívar,
Venezuela.
Se desarrolló una investigación de diseño
experimental, descriptivo, de campo, de corte
transversal. Se preparó un pool de dos Kg de arena
procedentes de diversas playas de Puerto Cabello
(El Palito, Playa Blanca, Quizandal), edo.
Carabobo, Venezuela a fin de minimizar
interferencias por variaciones granulométricas.
Dicho pool fue esterilizado en autoclave y
almacenado en frasco de vidrio con tapa hasta el
momento de su uso. Las unidades experimentales
consistieron en muestras de arena de 1, 5 y 10 g
dispuestas en placas de Petri (6 cm de diámetro) y
contaminadas a tres concentraciones diferentes
-1 -1 -1
(100 h (huevos) g arena, 200 h g arena y 400 h g
arena) a partir de una suspensión de huevos de
geohelmintos, a fin de evaluar el porcentaje de
recuperación de parásitos tras aplicar la técnica de
Willis. Este procedimiento se realizó por
triplicado, llamándose “Serie 1 g”, “Serie 5 g”,
“Serie 10 g”, cada una acompañada de un control
positivo que consistió en la misma cantidad de
arena de la serie, con el doble de la concentración
de huevos calculados para la misma, y un control
negativo que consistió en una cantidad de arena
estéril igual que el calculado para la serie.
Suspensión de geohelmintos
Se elaboraron tres (3) suspensiones de
concentrados de huevos de geohelmintos a fin de
determinar las condiciones ideales de preservación
de los mismos para desarrollar la fase experimental
de estandarización de la técnica de Willis.
-Concentrado de huevos de Ascaris lumbricoides
(Linnaeus, 1758), suspendidos en formalina al
10%
A partir de una deposición de adultos de A.
lumbricoides obtenidos de la desparasitación de un
paciente de una comunidad rural en el 2007,
conservados en formalina al 10%. Las hembras
adultas de A. lumbricoides se diseccionaron
mediante un corte longitudinal con un bisturí N° 5
para exponer las vías uterinas y luego otro corte
para extraer los huevos. Se resuspendieron los
MATERIALES Y MÉTODOS
Neotropical Helminthology, 2020, 14(1), ene-jun Estandarización de Willis en muestras de arena
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huevos extraídos con solución salina fisiológica
0,85% (SSF) y se centrifugó a 1500 rpm por 2 min y
30 seg. Se descartó el sobrenadante y se centrifugó
nuevamente a 3000 rpm por 30 seg. Se eliminó el
sobrenadante para concentrar la suspensión. Se
determinó la concentración de la suspensión de
huevos realizada. Por último, se conservaron los
huevos adicionando formalina al 10%.
-Concentrado de huevos de A. lumbricoides,
suspendidos en tampón fosfato salino, (PBS, por
sus siglas en inglés, Phosphate Buffer Saline)
Se extrajeron huevos a partir de las hembras adultas
de A. lumbricoides preservadas en formalina al
10%, realizando el mismo procedimiento descrito
inicialmente pero sustituyendo la formalina al 10%
por PBS.
-Concentrado de huevos de Anquilostomideos sin
preservantes
Se realizó una suspensión de huevos de
Anquilostomideos a partir de 5,49 g de deposición
fecal reciente de un paciente con una carga
parasitaria de 11.822 h por g de heces (hgh),
calculada según la técnica Kato Katz por
duplicado. Seguidamente se realizó el tamizaje de
toda la deposición fecal empleando una malla
metálica de 210 puntos de porosidad, a fin de
eliminar detritus y restos alimentarios. Se
homogeneizó y se disolvió en solución salina al
0,85% ajustando su concentración a valores
deseados para seguir el protocolo de
estandarización.
Estandarización de la técnica de Willis para la
recuperación de huevos de parásitos geohelmintos
en muestras de arena de playa
Se realizaron pruebas pilotos que consistieron en la
aplicación de la técnica de Willis en porciones de
arena procesadas por triplicado (serie 1 g, serie 5 g
y serie 10 g) a tres concentraciones distintas (100,
-1
200 y 400 h·g arena) de cada suspensión de huevos
de geohelmintos elaborada, seleccionando la que
presentó mayor recuperación parasitaria. Con la
suspensión de huevos de Anquilostomideos sin
preservantes se realizó el protocolo de
estandarización de la técnica, que consistió en
nueve tratamientos según las variables
manipuladas (Tabla 1).
Técnica de Willis
Seguidamente a la contaminación de las unidades
experimentales, se agregó suficiente solución
saturada de cloruro de sodio al 33% hasta la boca de
la placa de Petri, y se mezclaron con aplicadores de
madera. Luego se colocó una lámina portaobjetos,
se adicionó más solución hasta que se logró el
contacto de la misma con la lámina. Se dejó reposar
por veinte (20) min. Se procedió a voltear
rápidamente para cuantificar microscópicamente
la cantidad de huevos recuperados recorriendo toda
la lámina con el microscopio óptico a 100X.
Empleando la misma preparación, en cada placa de
Petri, se puso en contacto una segunda lámina
portaobjetos, dejando reposar por veinte (20) min.
Validación de la Técnica de Willis estandarizada
-Validación de la Técnica estandarizada de Willis
con muestras de arena de concentración
parasitaria conocidas
Se preparó un pool de muestras fecales frescas sin
preservantes proveniente de dos pacientes de una
comunidad indígena del estado Amazonas, con alta
carga parasitaria, evaluados previamente en el
marco de un proyecto de desparasitación de la
Fundación Tierra Blanca del Departamento de
Parasitología, Facultad de Ciencias de la Salud,
Universidad de Carabobo Sede Carabobo,
Venezuela. La suspensión de estos huevos de
geohelmintos en solución salina al 0,85% se realizó
de igual manera que para la suspensión de
Anquilostomideos sin preservantes. Siguiendo las
condiciones óptimas de trabajo para la Técnica de
Willis; se contaminaron 10 g de arena a dos
-1
concentraciones parasitarias (400 h·g arena y 800
-1
h·g arena) por triplicado a partir de la suspensión
de huevos de geohelmintos en SSF preparada
previamente. El control positivo para cada serie
consistió en 10 g de arena contaminada con el doble
de concentración parasitaria de cada serie.
-Validación de la Técnica estandarizada de Willis
con muestras experimentales
Se realizó un muestreo de campo en dos lugares
con características topográficas y condiciones
granulométricas del suelo diferentes para evaluar
comportamiento de la técnica de Willis en
condiciones ambientales diversas.
-Validación de la Técnica estandarizada de Willis
con muestras de arena de Playa Blanca, municipio
Puerto Cabello, edo. Carabobo
Se llevó a cabo un muestreo de campo en el
Neotropical Helminthology, 2020, 14(1), ene-jun Guerrero-De Abreu et al.
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Balneario Playa Blanca, municipio Puerto Cabello,
en el mes de Abril 2018 (posterior a vacaciones de
Semana Santa), en la cual se ha demostrado la
presencia de formas parasitarias de interés
sanitario (Guerrero et al., 2014). Playa Blanca
consta de un espacio territorial costero de
2
aproximadamente 180 Km y una extensión
aproximada de 980 m de costa, ubicado en la zona
central de Puerto Cabello, estado Carabobo,
orientado al Norte con el Mar Caribe (MPPD,
2015), de coordenadas: 10°28'33.2"N
68°01'36.9"W.
Se trazaron dos (2) transectas, la primera
correspondiente a la franja de arena mojada que
corresponde justo a orilla del mar, y la otra a la
franja de arena seca ubicada aproximadamente a
unos 14 m de la orilla del mar. Se tomaron 5 puntos
geográficos en cada franja, aplicando un muestreo
sistemático que cubriera la extensión de la playa, y
mediante un recorrido en "V" contrapuestos
(Sievers et al., 2007) (Fig. 1). En cada punto de
muestreo se delimitó un área de 10 cm de diámetro
y 5 cm de profundidad (Santarém et al., 1998;
Cassenote et al., 2011) para recolectar 500 g de
arena en cada punto de muestreo, recopiladas entre
las 7:30 am y 8:30 am; almacenadas en bolsas de
plástico de cierre hermético para su trasporte y
procesamiento en el laboratorio en un periodo no
mayor a 48 h.
Se procesaron un total de 10 muestras de arena por
duplicado bajo las condiciones de estandarización
de la técnica de Willis, empleando un control
positivo que consistió en 10 g de arena
-1
contaminada con 400 h·g a partir de la suspensión
de huevos de Anquilostomideos en SSF 0,85% sin
preservantes.
-Validación de la Técnica estandarizada de Willis
con muestras de suelo de la Comunidad Caño
Pendare, municipio Cedeño, edo. Bolívar.
Se probó la técnica estandarizada de Willis en
muestras de suelo de la comunidad indígena (de la
etnia Piaroa) Caño Pendare, que presentó una
prevalencia de helmintiasis intestinal de 30,5% en
ese mismo año. Se realizó un muestreo intencional
en los alrededores de cada vivienda de la
comunidad (n=70), para reconocer el riesgo de
contaminación parasitario del núcleo familiar, en el
marco de una jornada de diagnóstico
parasitológico llevado a cabo por la Fundación
Tierra Blanca. Cada punto de muestreo se
estableció a 0 m, 10 m, 20 m de distancia con
relación a la vivienda mediante un recorrido en
línea recta (según lo permitido por la topografía) en
dirección a zonas en la que los lugareños señalaban
la deposición de materia fecal a cielo abierto. En
cada punto de muestreo se delimitó un área de 10
cm de diámetro y 5 cm de profundidad (Santarém et
al., 1998; Cassenote et al., 2011). Se procesaron
189 muestras de tierra de casas habitadas por
duplicado bajo las condiciones óptimas
determinadas en la estandarización de la técnica de
Willis.
Esta comunidad está conformada por población
indígena etnia Hûatojja (Piaroas), en el municipio
Manuel Cedeño del edo. Bolívar; a las riberas del
Rio Parguaza. Las coordenadas corresponden a
6°06'02.8"N 67°04'01.6"W, abarcando una
superficie total de 219.316,60 m².
Análisis de datos
La captación de la información se realizó en
M i c r o s o f t E x c e l 2 0 1 3 ( M i c r o s o f t
corporation®,1997). Se construyó una base de
datos y se expresó en frecuencia la positividad o no
para parásitos en las muestras procesadas de cada
una de las condiciones ensayadas y de cada uno de
los puntos de muestreo. Se aplicó un análisis de
varianza con arreglo factorial para datos no
paramétricos de Kruskal Wallis, registrando el
número de huevos de helmintos en cada
procedimiento y el porcentaje de recuperación
parasitaria, a fin de conocer el mejor tratamiento
(combinación de variables manipuladas por el
investigador) para la técnica de Willis, donde las
diferencias estadísticas de cada grupo se
determinaron calculando el contraste múltiple de
rangos. Se calculó la diferencia de dos
proporciones muestrales considerando los
porcentajes de recuperación de huevos de
helmintos en las muestras controles de 400 y 800
-1
h·g arena en el proceso de validación de la técnica,
así como la diferencia entre los porcentajes de
recuperación de cada especie parasitaria de la
suspensión de geohelmintos empleada para la
validación. Por último, se consideraron los
resultados de recuperación parasitaria (en términos
de porcentaje de recuperación y conteo absoluto de
parásitos) obtenidos en las condiciones óptimas de
estandarización y en las de validación con muestras
controles, para el cálculo de la regresión lineal, a
Neotropical Helminthology, 2020, 14(1), ene-jun Estandarización de Willis en muestras de arena
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fin de estimar la respuesta de la técnica de Willis
ante concentraciones parasitarias diferentes a las
probadas en la presente investigación.
Aspectos éticos
Los autores declaran que se cumplieron todos los
aspectos éticos del país e internacionales.
Evaluación de las suspensiones de geohelmintos
En las pruebas pilotos se demostró que los
preservantes usados en las suspensiones de huevos
de geohelmintos generaban interferencias en la
flotación de los huevos durante la ejecución de la
técnica de Willis (p = 0,00). La suspensión de
huevos de Anquilostomideos sin aditivos resultó
más efectiva (Tabla 1), con un porcentaje de
recuperación mínimo de 4,4% y un máximo de
82,5%, razón por lo que fue usada para el desarrollo
del protocolo de estandarización de la técnica de
Willis, con la precaución de realizar el
procedimiento dentro de las 72 h siguientes,
evitando la degradación de las formas parasitarias.
Estandarización de la Técnica de Willis
Se obtuvieron diferencias estadísticamente
significativas entre los porcentajes de recuperación
parasitaria obtenidos en los diversos tratamientos
(p = 0,00) (Tabla 2, Fig. 1A). La contaminación de
10 g de arena con la suspensión de
-1
Anquilostomideos a una concentración de 400 h·g
(tratamiento 9) generó mayor porcentaje de
recuperación en comparación al resto de los
experimentos, con valores entre 67,8% y 82,5% de
recuperación parasitaria, con una media de 77,3%.
De igual manera se muestran diferencias
estadísticamente significativas entre los
tratamientos según el número total de huevos
recuperados (p = 0,00) (Tabla 2, Fig. 1B).
Se encontraron diferencias estadísticamente
significativas entre los porcentajes de recuperación
de huevos tras las variaciones de concentración de
huevos de Anquilostomideos empleadas en el
proceso de estandarización (p = 0,00) (Tabla 2, Fig.
-1
2A), siendo la concentración de 400 h·g la de
mayor porcentaje de recuperación, con una media
de 66,0%; que corresponde con un promedio 1.494
huevos (p = 0,00) (Tabla 2, Fig. 2B).
Por su parte, no se obtuvieron diferencias entre los
porcentajes de recuperación parasitaria de las serie
de 1 g, 5 g y 10 g de arena contaminadas
experimentalmente (p = 0,63), con 45,4%, 35,0% y
44,0% de recuperación respectivamente (Tabla 2,
Fig. 2C). Estos resultados contrastan con las
diferencias evidenciadas entre el número absoluto
de huevos recuperados y las series de arena
evaluada (p = 0.0099), donde la serie de 10 g
registró el mayor promedio con 1.341 huevos de
Anquilostomideos contabilizados (Tabla 2, Fig.
2D).
RESULTADOS
Huevos fértiles e infértiles de A.
lumbricoides
Tipo de
Suspensión
Especie parásita contenida
Total de
huevos en
el vial
(h·vial-1)
Concentración
parasitaria
(h·mL- 1)
Volumen
nal (mL)
Rango de
recuperación
parasitaria (%)
En formalina 10%
Huevos fértiles e infértiles de A.
lumbricoides
555.750
37.050
15
0 -8,1
En PBS
800.000
20.000
40 0-0,6
En SSF sin
preservantes Huevos de Anquilostomideos 56.000 1.120 50 4,4-82,5
Tabla 1. Recuperación parasitaria según las suspensiones de geohelmintos evaluadas para la estandarización de la
técnica de Willis.
Neotropical Helminthology, 2020, 14(1), ene-jun Guerrero-De Abreu et al.
40
41
Tabla 2. Tratamiento según cantidad de arena y huevos del parásito con muestras controles.
Tratamiento Serie
arena
(g)
Concentración
(h·g-1)
Nº huevos
Adicionados
Promedio huevos
recuperados
Promedio de
porcentaje de
recuperación (%)
1 1 100 100 23,33
23,33
2 5 100 500 119,00
23,80
3
10
100
1000
158,33
15,83
4
1
200
200
97,67
48,83
5
5
200
1000
242,67
24,27
6
10
200
2000
776,00
38,80
7
1
400
400
256,00
64,00
8 5 400 2000 1137,00 56,85
9 10 400 4000 3090,00 77,25
Figura 1. A. Porcentaje de recuperación de huevos geohelmintos según tratamiento. B. Número de huevos recuperados según
tratamiento.
Tabla 3. Porcentaje de recuperación de huevos de geohelmintos según la especie.
Especie
Proporción
de arena
contaminada
(g)
Serie 400 h·g-1
Serie 800 h·g-1
P valor
(α=0,05)
Nº huevos
adicionados
N° huevos
recuperados
Porcentaje
recuperación
(χ±2DE)
Nº huevos
adicionados
N° huevos
recuperados
Porcentaje
recuperación
(χ±2DE)
A. lumbricoides
10
3734
2140
57,3 ±2,1
7476
3356 44,9± 4,0 0,00
Anquilostomideos
10
178
118
66,1± 6,7
356
336 94,4± 9,9 0,02
T. trichiura 10 89 10 11,6±1,5 178 24 13,5± 3,1 0,08
Total geohelmintos 10 4000 2268 56,7± 2,7 8000 3716 46,5 ±4,4 0,00
Neotropical Helminthology, 2020, 14(1), ene-jun Estandarización de Willis en muestras de arena
Figura 2. A. Porcentaje de recuperación parasitaria según concentración. B. Número de huevos recuperados según
concentración. C. Porcentaje de recuperación parasitaria según serie arena. D. Numero de huevos recuperados según serie arena.
42
Validación de la Técnica de Willis
-Validación de la técnica estandarizada con
muestras de arena de concentración parasitaria
conocidas
La suspensión de Anquilostomideos sin
preservantes presentó un conteo de 506.250
-1
huevos·vial para una concentración de 4.500
-1
h·mL , conteniendo huevos fértiles e infértiles de
A. lumbricoides, Anquilostomideos sp. y Trichuris
trichiura (Linnaeus, 1771), que fue utilizada para
la contaminación experimental de muestras de
arena en el proceso de validación. El porcentaje de
recuperación de huevos de geohelmintos de
acuerdo a la especie, se resume en la Tabla 3.
-Validación de la Técnica estandarizada de Willis
con muestras experimentales
El 100% de las muestras de arena de Playa Blanca
procesadas siguiendo la técnica estandarizada
resultaron negativas para formas parasitarias de
importancia sanitaria, manteniéndose resultados
positivos en las muestras control. Sin embargo, se
demostró la presencia de huevos de A.
lumbricoides en 18,5% de 189 muestras analizadas
de suelos de la comunidad Caño Pendare,
Municipio Cedeño, edo. Bolívar; correspondiendo
48,6% de las muestras positivas a suelo arcillosos y
51,4% a suelos rocosos.
No se consiguió relación lineal entre porcentaje de
recuperación y la concentración de la suspensión
de huevos geohelmintos empleada para la
contaminación experimental de 10 g de arena de
playa (r = 0,18; p = 0,16). Por su parte, se obtuvo
una regresión lineal significativa entre el número
de huevos recuperados y la concentración de la
suspensión de huevos geohelmintos empleada para
la contaminación experimental de 10 g de arena de
playa (r = 0,82; p = 0,00), que se explica mediante
la fórmula lineal: Nº huevos recuperados = 8,28 +
-1
5,13* Concentración (h·g arena procesada).
Neotropical Helminthology, 2020, 14(1), ene-jun Guerrero-De Abreu et al.
-1
Concentración (h·g arena) -1
Concentración (h·g arena)
43
estandarizada de Willis (77,3%) superó a lo
reportado por Oge & Oge (2000), en la que obtuvo
14,6% de recuperación de huevos de Toxocara spp.
por la técnica de centrifugación y flotación descrita
por Dunsmore et al. (1984). En este sentido, Pérez
& Raña (2016), resaltan que la técnica de Willis les
permitió la recuperación de más huevos de
helmintos que la técnica de sedimentación-
flotación, en todas las soluciones de flotación
probadas en su investigación.
Algunas investigaciones (Quinn et al., 1980;
Kazacos, 1983; Dunsmore et al., 1984; Sievers et
al., 2007; Pérez & Raña, 2016) sugieren realizar un
paso previo a la realización de la técnica de
flotación, que consiste en el lavado de las muestras
con algún detergente aniónico (Tween 20 o Tween
80) con el fin de reducir la tensión superficial de los
líquidos permitiendo una mejor disgregación de las
partículas que facilitaría la detección de huevos en
las muestras de suelo. Sin embargo, el proceso de
filtración que sigue luego de lavados con
detergente aniónico, pudiera generar pérdidas de
huevos de helmintos en la muestra de suelo
(Santarém et al., 2009), y además se ha demostrado
que los terrenos arenosos presentan menos
variación en el porcentaje de recuperación, ya que
sus partículas mantienen a los huevos más sueltos
facilitando su flotación (Dubin et al., 1975; Oge &
Oge, 2000). Dado a que la arena de las playas de
Puerto Cabello está compuesta por gránulos muy
finos y los componentes orgánicos tales como
troncos, ramas o piedras fueron fácil y
manualmente extraídos del pool de muestras de
arena que fue esterilizada para la contaminación
experimental, no fue necesario realizar lavados
previos, por lo que la ejecución de la técnica de
flotación resultó un proceso de un solo paso.
Las condiciones óptimas de trabajo se lograron
empleando 10 g de arena contaminadas a
- 1
concentraciones iguales a 400 h·g . La
visualización microscópica de las láminas del
proceso de Willis resultó fácil de realizar, con
campos relativamente limpios de detritus e
impurezas y donde las pocas partículas de arena
presentaron una distribución uniforme que facilitó
la identificación de las formas parasitarias. Tal
como se describen en otros análisis (Oge & Oge,
2000; Pérez & Raña, 2016), se realizó la
visualización de dos láminas por cada muestra de
arena procesada a intervalos de 20 min cada una,
Los huevos de A. lumbricoides de las suspensiones
de formalina al 10% y PBS que se obtuvieron a
partir de la disección de hembras adultas
preservadas durante largo tiempo en formalina al
10%, no fueron exitosas para la recuperación de
huevos de geohelmintos por la técnica de flotación
de Willis. La formalina genera puentes cruzados
con los grupos amino, carboxilo e indol de las
proteínas, dando lugar a fuertes uniones entre
moléculas proteicas, con gran poder endurecedor;
por lo que aquellas células que se mantienen por
largo tiempo fijados con formalina 10% presentan
variación de dimensiones orgánicas, afectando
peso y medida de huevos de helmintos y por ende la
densidad, afectando su flotación en la técnica de
Willis durante la estandarización (Duque & Díaz,
1999).
Investigaciones anteriores emplearon gusanos
adultos de helmintos intestinales viables a partir de
una deposición fecal recién emitida (Santarém et
al., 2009) o provenientes de autopsias de canes
(Oge & Oge, 2000). Resultó un gran reto obtener
una muestra fecal fresca con una alta carga
parasitaria de geohelmintos que permitiera realizar
una suspensión de suficiente volumen y
concentración parasitaria para cumplir con el
protocolo de estandarización. El vial resultante con
huevos de Anquilostomideos en suspensión en SSF
al 0,85% demostró presentar mayor nivel de
recuperación (p = 0,00), por lo que fue
seleccionada para la re alización de la
estandarización de la técnica de flotación de Willis.
Tomando en cuenta que los huevos de
Anquilostomideos son frágiles y tienden a
eclosionar rápidamente (Brooker et al., 2015), se
realizó el procedimiento experimental durante las
siguientes 72 h de haber elaborado dicha
suspensión, manteniéndola refrigerada a 4ºC
durante todo el proceso.
Todas las muestras de arena contaminadas
resultaron positivas para la técnica de Willis
durante la estandarización; evidenciando su
efectividad, considerando que con observar una
sola forma parasitaria se demuestra el riesgo de
infección en suelos de zonas recreacionales.
Además, el promedio del porcentaje de
recuper a c ión parasit a r ia en la té c n ica
DISCUSIÓN
Neotropical Helminthology, 2020, 14(1), ene-jun Estandarización de Willis en muestras de arena
existentes han determinado que Willis es
particularmente útil en la detección de huevos de
Anquilostomideos en muestras fecales (Nuñez
1991; Navone et al. , 2005), en virtud de que estos
huevos miden aproximadamente entre 56-75 μm
por 34-57 μm, con una gravedad específica (GE) de
1,06, mientras que los huevos de A. lumbricoides
presentan una GE entre 1,09 y 1,10 según sus
variaciones en tamaño, evolución y condición de
fertilidad (David & Lindquist, 1982). Es por ello
que la técnica estandarizada resultó ser mucho más
eficiente para los huevos de Anquilostomideos
(66,1% a 94,4%), que coincide e incluso supera el
obtenido en la estandarización (60% a 80%),
mientras que los huevos de A. lumbricoides
manifestaron un porcentaje ligeramente inferior a
lo estandarizado (57,3%-44,9%) y los huevos de T.
trichiura registraron el menor nivel de
recuperación (11,6%-13,4%).
Por ello, la técnica estandarizada de Willis es
particularmente útil para la detección del riesgo de
trasmisión de Larva Migrans Cutánea (LMC) en
playas de Venezuela, donde se presentan climas
cálidos, suelos arenosos y de alta humedad
(>80%); condiciones favorables para la sobrevida
de Anquilostomideos (Plascencia, 2013), y cuya
contaminación ambiental fue demostrada por
Guerrero et al. en Playa Blanca en el 2014 y
Guerrero et al. (2015) en Playa Quizandal, ambas
en el Municipio Puerto Cabello. Sin embargo,
durante el proceso de validación de la técnica
estandarizada en Playa Blanca no se observaron
formas parasitarias, lo que parece indicar que en el
mom ent o d el mu est r eo los ni v ele s d e
contaminación parasitaria fueron mínimos (no
detectables). No obstante, el muestreo de suelos en
la comunidad indígena Caño Pendare de la etnia
Piaroa, que presentó una prevalencia helmintiasis
intestinal de 30,5% en ese mismo año; demostró
que la técnica de Willis estandarizada es válida para
muestras de suelo a pesar de la diversidad de
características geológicas, cuando la fuente de
contaminación ambiental con materia fecal es
constante.
La correlación lineal encontrada entre el número de
huevos contabilizados y la concentración
parasitaria de la suspensión empleada para la
contaminación experimental de porciones de arena
de playa (r = 0,82; p = 0,00) indica que no hay otros
elementos interferentes, donde el 82,76% de las
para incrementar la posibilidad de recuperación
parasitaria.
En relación a la cantidad de arena recomendada
para ser procesada por la técnica de flotación
simple de Willis existe mucha discrepancia;
pudiendo variar desde 100 g (Devera et al., 2008,
2015); 50 g (Milano & Oscherov 2002; Cazorla et
al, 2007; Apóstol et al., 2013; Pérez & Raña, 2016),
20 g (Guerrero et al., 2015) y hasta un mínimo de
10 g de arena (Nunes et al., 2000). La
estandarización de la técnica de Willis se diseñó a
una escala que permitiera el fácil procesamiento de
las muestras, considerando los implementos de
laboratorio disponibles y cuyos resultados
permitieran su comparación con las variaciones de
porciones de arena referenciadas, obteniendo
como resultado que la proporción de arena no tiene
influencia directa en la mayor probabilidad de
recuperación de formas parasitarias (p = 0,63), sino
que depende de la concentración de huevos de
geohelmintos que puedan estar esparcidos en una
extensión de terreno dada (p = 0,00). Así también lo
demostró Oge & Oge (2000), mediante técnica de
flotación descrita por Dunsmore et al. (1984) y
Kazacos (1983) durante la contaminación
experimental de 50 g de arena con huevos de
Toxocara spp, y Pérez & Raña (2016) resaltan que
la recuperación parasitaria está influida por el
grado de contaminación de las muestras de arena y
en algunos casos por la soluciones de flotación
utilizada.
En el proceso de validación se evidenció un nivel
de recuperación de huevos de geohelmintos
significativamente mayor en las muestras
-1
contaminadas a una concentración de 400h·g
-1
arena (p = 0,00) en relación a la de 800h·g arena,
debido a que en ésta última se generó la flotación de
numerosos huevos de geohelmintos, que dificultó
el conteo meticuloso, tomando en cuenta que la
visualización de la preparación en el microscopio
óptico debe realizarse rápidamente, para prever la
evaporación de la solución con la consecuente
formación de precipitados de cristales de cloruro de
sodio que impiden la adecuada identificación
parasitaria.
Para la selección de la técnica parasitológica se
debe considerar, entre otras cosas, las formas
parasitarias que esperan encontrarse. Así, las
comparaciones entre técnicas coproparasitológicas
Neotropical Helminthology, 2020, 14(1), ene-jun Guerrero-De Abreu et al.
44
variaciones del número de huevos de geohelmintos
recuperados se debe al número de huevos añadidos
durante la contaminación experimental y no al
azar. Lógicamente, el mínimo conteo de huevos
que es posible recuperar es un huevo de
geohelmintos, cuya probabilidad de detección no
se pudo explicar a través de una relación lineal
entre el porcentaje de recuperación parasitaria
según la concentración de huevos de la suspensión
empleada (p = 0,16), demostrando que la
probabilidad de detección de huevos por la técnica
estandarizada no solo depende de la concentración
de parásitos en las porciones de arena procesadas,
sino de la homogeneidad de distribución
parasitaria en el medio ambiente, por lo cual la
positividad de la técnica también se ve influida por
la metodología de muestreo (Sievers et al., 2007),
de la frecuente exposición a agentes contaminantes
y de variaciones climáticas, por lo cual se
recomienda realizar muestreos frecuentes y en
diferentes períodos del año (ya que el factor
climático y exposición humana y canina también
influyen), para incrementar la probabilidad de
detección parasitaria.
La técnica estandarizada de Willis por si misma
resultó efectiva para la recuperación de huevos de
geohelmintos, empleando una solución de cloruro
de sodio de fácil preparación y bajo costo,
mediante un procedimiento técnico sencillo y
rápido, siendo apropiada para estudios de
prevalencia donde se requiere analizar un gran
número de muestras y abarcar gran extensión de
terreno. Se recomienda la visualización
microscópica de al menos dos láminas portaobjetos
con el material resuspendido por cada porción de
arena analizado, ya que esto incrementa el número
de huevos que son recuperados y contabilizados
durante la evaluación sanitaria del suelo
muestreado.
Además, se sugiere la aplicación de la técnica de
sedimentación espontánea conjuntamente con la
técnica de Willis estandarizada durante las
evaluaciones sanitarias de suelos de zonas
recreacionales, a fin de aumentar el rango de
detección de todos los estadios evolutivos y para
las diversas especies parasitarias.
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