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Gastrointestinal Parasitism in Rescued Wild Birds
Neotropical Helminthology (Lima). Vol. 18, N
º
2, jul - dec 2024
Neotropical Helminthology
Neotropical Helminthology, 2024, vol. 18 (2), 207-215
ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL
AN ALTERNATIVE TECHNIQUE FOR PREPARING MONOGENEANS
UMA TÉCNICA ALTERNATIVA PARA A PREPARAÇÃO
DE MONOGENÉTICOS
UNA TÉCNICA ALTERNATIVA PARA LA PREPARACIÓN
DE MONOGENEOS
Moisés Gallas
1
* & Eliane Fraga da Silveira
1
ISSN Versión Impresa 2218-6425 ISSN Versión Electrónica 1995-1403
DOI: https://dx.doi.org/10.62429/rnh20242181822
Universidad Nacional
Federico Villarreal
Volume 18, Number 2 (jul - dic) 2024
Este artículo es publicado por la revista Neotropical Helminthology de la Facultad de Ciencias Naturales y Matemática, Universidad Nacional Federico
Villarreal, Lima, Perú auspiciado por la Asociación Peruana de Helmintología e Invertebrados Af nes (APHIA). Este es un artículo de acceso abierto,
distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Atribución 4.0 Internacional (CC BY 4.0) [https:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/
deed.es] que permite el uso, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada de su fuente original.
ABSTRACT
Monogeneans encompass a group of parasites whose identif cation requires the visualization of both internal and external
morphology. In most cases, the techniques involve many steps and the use of restricted substances, in addition to
the necessity of protective equipment. Faure’s mounting medium, an aqueous medium similar to Hoyer’s mounting
medium, has already been used for the preparation of the group. T is study aimed to evaluate the ef ectiveness of Faure’s
medium for the mounting of stained specimens. For this purpose, specimens of
Microcotyle pomatomi
Goto, 1900 and
Gotocotyla acanthura
(Parona & Perugia, 1896) Meserve, 1938, collected from
Pomatomus saltatrix
(Linnaeus, 1766)
in the southernmost part of Brazil were used. T e monogeneans were stained with f ve dif erent dyes and mounted
between a slide and coverslip using Faure’s mounting medium. T e specimens that exhibited the best results were stained
with Gomori’s trichrome and Semichon’s acetic carmine. Monogeneans stained with eosin and fast green showed less
satisfactory results, primarily because they did not highlight the structures of the reproductive systems. T e analysis
after years of preparation revealed that the characteristics and conditions of the staining and preparations remained in
good condition, ensuring durability. T e technique presented establishes a quick and ef ective method and provides an
alternative for mounting monogeneans, especially when dealing with large infrapopulations.
Keywords:
Faure’s medium ‒ Gomori’s trichrome ‒ method ‒ mounting ‒ Semichon’s acetic carmine ‒ staining
1
Laboratório de Zoologia dos Invertebrados, Museu de Ciências Naturais, Universidade Luterana do Brasil, Canoas, 92425-
900, Rio Grande do Sul, Brazil.
* Corresponding author: mgallas88@gmail.com
Moisés Gallas:
https://orcid.org/0000-0003-4525-009X
Eliane Fraga da Silveira:
https://orcid.org/0000-0002-0992-5136
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Neotropical Helminthology (Lima). Vol. 18, N
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Gallas & Fraga da Silveira
RESUMO
Monogenéticos compreendem um grupo de parasitos cuja identifcação necessita a visualização da morfologia interna
e externa. Na maioria dos casos, as técnicas requerem muitas etapas e a utilização de substâncias de uso restrito, além
da necessidade de equipamentos para proteção. O meio de montagem de Faure, um meio aquoso similar ao meio de
montagem de Hoyer, já foi utilizado para a preparação do grupo. O objetivo deste estudo foi avaliar a efcácia do meio
de Faure na montagem de monogenéticos corados. Foram utilizados espécimes de
Microcotyle pomatomi
Goto, 1900 e
Gotocotyla acanthura
(Parona & Perugia, 1896) Meserve, 1938, coletados de
Pomatomus saltatrix
(Linnaeus, 1766) no
extremo sul do Brasil. Os monogenéticos foram corados com cinco corantes e montados entre lâmina e lamínula com
o meio de montagem de Faure. Os melhores resultados foram obtidos com os espécimes corados com tricrômico de
Gomori e carmim acético de Semichon. Monogenéticos corados com eosina e
fast green
apresentaram resultados menos
satisfatórios, principalmente por não evidenciarem as estruturas dos sistemas reprodutores. A análise realizada após
anos da preparação evidenciou que as características e condições das colorações e preparações permaneceram em bom
estado, garantindo a durabilidade. A técnica apresentada é um método rápido e efcaz, e constitui uma alternativa para a
montagem de monogenéticos, principalmente quando são encontradas infrapopulações numerosas.
Palavras-chave:
carmim acético de Semichon ‒ coloração ‒ meio de Faure ‒ método ‒ montagem ‒ tricrômico de
Gomori
RESUMEN
Los monogeneos son un grupo de parásitos cuya identifcación depende de la visualización de su morfología interna y
externa. En la mayoría de los casos, las técnicas requieren múltiples pasos y el uso de sustancias restringidas, además de
la necesidad de equipos de protección. El medio de montaje de Faure, un medio acuoso similar al medio de montaje
de Hoyer, ya se ha utilizado para la preparación de estos parásitos. El objetivo de este estudio fue evaluar la efcacia del
medio de Faure en el montaje de monogeneos coloreados. Se utilizaron especímenes de
Microcotyle pomatomi
Goto,
1900 y
Gotocotyla acanthura
(Parona & Perugia, 1896) Meserve, 1938, colectados de
Pomatomus saltatrix
(Linnaeus,
1766) en el extremo sur de Brasil. Los monogeneos fueron coloreados con cinco colorantes y montados entre la lámina
y el cubreobjetos utilizando el medio de montaje de Faure. Los mejores resultados se obtuvieron con los especímenes
coloreados con tricrómico de Gomori y carmín acético de Semichon. Los monogeneos coloreados con eosina y
fast
green
presentaron resultados menos satisfactorios, especialmente porque no evidenciaron las estructuras de los sistemas
reproductores. El análisis realizado después de años de preparación demostró que las características y condiciones de
las coloraciones y preparados se mantuvieron en buen estado, garantizando la durabilidad. La técnica presentada es en
método rápido y efcaz, y se presenta como una alternativa para el montaje de monogeneos, especialmente cuando se
encuentran infrapoblaciones numerosas.
Palabras clave:
carmín acético de Semichon ‒ coloración ‒ medio de Faure ‒ método ‒ montaje ‒ tricrómico de Gomori
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Technique for preparing monogeneans
Neotropical Helminthology (Lima). Vol. 18, N
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INTRODUÇÃO
Um dos procedimentos para identifcar uma espécie
de parasito é a coloração dos espécimes, como é o caso
dos monogenéticos, através de diferentes protocolos
(Yamaguti, 1965; Pritchard & Kruse, 1982; Mo &
Appleby, 1990; Amato
et al
., 1991; Richards & Chubb,
1995; Deveney & Whittington, 2001; Chaudhary
et
al
., 2004; Cribb
et al
., 2004; Eiras
et al
., 2006; Wong
et al
., 2006; Košková
et al
., 2010; García-Vásquez
et al
.,
2012; Justine
et al
., 2012; Ayadi
et al
., 2022; Nejat
et al
.,
2023; Ramírez-Cruz
et al
., 2023). Essas técnicas foram
desenvolvidas para processar espécimes para estudos
morfológicos e mais recentemente, para pesquisas de
obtenção de material genético e estudos moleculares.
Um dos problemas enfrentados pelos parasitologistas que
estudam a morfologia dos helmintos, e particularmente
dos monogenéticos, é a montagem permanente de
espécimes em lâminas. Esse processo normalmente requer
um corante, usualmente o tricrômico de Gomori, para
evidenciar as estruturas morfológicas que serão úteis para
a identifcação (Amato
et al
., 1991; Eiras
et al
., 2006;
Tatcher, 2006). Posteriormente à coloração, existe um
processo de clarifcação ou diafanização para incorporação
em um meio de montagem. Para a clarifcação dos
monogenéticos, muitos protocolos apresentam a utilização
de uma substância que na maioria das vezes é tóxica e/ou
cancerígena (Brasil, Ministerio da Saúde, 2013), como é
o caso do xileno e do creosoto de Faia (Yamaguti, 1965;
Pritchard & Kruse, 1982; Amato
et al
., 1991; Eiras
et
al
., 2006). Adicionalmente, a manipulação do material
em contato com essas substâncias requer cuidado e a
utilização de equipamentos de proteção individual e
coletiva, como é o caso das cabines de segurança.
O meio de montagem de Faure constitui em um meio
aquoso, com composição similar ao meio de Hoyer
(Sewell
et al
., 2006; Amato & Amato, 2010), que é muito
utilizado para a montagem de monogenéticos (Eiras
et
al
., 2006; Tatcher, 2006). O meio de montagem de
Faure vem sendo usado para a montagem de estruturas
de diferentes grupos, como os temnocefalídeos (Seixas
et al
., 2018), monogenéticos (Gallas
et al
., 2014, 2015,
2016) e os cestoides (Silveira & Amato, 2008, 2010).
Contudo, as preparações obtidas diretamente com o
meio de montagem de Faure permanecem sem coloração,
o que difculta a visualização de estruturas internas.
Diferentes autores desenvolveram protocolos utilizando
espécimes corados para a preparação em meios de
montagem. Kritsky
et al
. (1978) apresentaram uma técnica
na qual espécimes de monogenéticos foram corados pelo
tricrômico de Gomori e após foram montados com meio
de montagem de Gray & Wess. Similarmente, Gallas
et
al
. (2015) utilizaram uma técnica na qual monogenéticos
foram corados pelo carmim de Semichon e montados
com o meio de montagem de Faure. No presente estudo,
foi avaliada a efcácia da técnica de Gallas
et al
. (2015)
e a utilização de diferentes corantes com o meio de
montagem de Faure.
MATERIAL E MÉTODOS
Espécimes de
Microcotyle pomatomi
Goto, 1900 e
Gotocotyla acanthura
(Parona & Perugia, 1896) Meserve,
1938 utilizados no presente estudo foram coletados de
Pomatomus saltatrix
(Linnaeus, 1766) do município de
Tramandaí, Rio Grande do Sul, extremo sul do Brasil.
Os monogenéticos foram fxados em formalina 5% e
conservados em etanol 70° GL (Gallas
et al
., 2014). A
identifcação dos parasitos foi realizada de acordo com
Yamaguti (1963) e Cohen
et al
. (2013).
Monogenéticos foram corados por 3 a 10 minutos em
cada corante, de acordo com as fórmulas descritas em
diferentes protocolos: tricrômico de Gomori (Humason,
1979), carmim acético de Semichon (Amato & Amato,
2010), hematoxilina de Delafeld (Humason, 1979;
Amato & Amato, 2010), eosina (Humason, 1979) e
fast
green
(Humason, 1979). Posteriormente, cada espécime
foi transferido com uma agulha histológica para uma
lâmina com uma gota do meio de montagem de Faure
e coberto com uma lamínula. A fórmula do meio de
montagem de Faure utilizada seguiu Amato & Amato
(2010).
Para comparar a efcácia da coloração e preparação, os
espécimes foram observados logo após a montagem e
acompanhados durante nove anos. As lâminas montadas
foram armazenadas em caixas porta lâminas de material
ABS (
acrylonitrile butadiene styrene
), com capacidade
para 50 lâminas e mantidas em temperatura ambiente.
Fotomicrografas foram realizadas utilizando uma câmera
acoplada a um microscópio de luz. As lâminas foram
depositadas na Coleção Helmintológica (CHMU) no
Museu de Ciências Naturais da Universidade Luterana do
Brasil (ULBRA), em Canoas, Rio Grande do Sul, Brasil.
Aspectos éticos
: os parasitos utilizados fazem parte do
material da Coleção Helmintológica (CHMU 206,
CHMU 222, CHMU 226) do Museu de Ciências
Naturais da ULBRA, Brasil. Os peixes foram obtidos
comercialmente, todos adquiridos mortos.
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Neotropical Helminthology (Lima). Vol. 18, N
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Gallas & Fraga da Silveira
RESULTADOS
Os monogenéticos utilizados apresentaram tamanho total
do corpo entre 3,40 a 8,62mm. Os espécimes corados
com tricrômico de Gomori e carmim acético de Semichon
apresentaram os melhores resultados, com a maioria das
estruturas morfológicas possíveis de visualização (Tabela
1, Fig. 1). Os monogenéticos corados com hematoxilina
de Delafeld apresentaram resultados pouco satisfatórios
e os corados com eosina e o
fast green
apresentaram,
principalmente, as estruturas relacionadas aos sistemas
reprodutores de difícil ou nenhuma visualização (Tabela
1, Fig. 2).
Na preparação com o meio de montagem de Faure,
foi visualizada uma pequena remoção dos corantes
quando os espécimes foram transferidos para o meio.
Adicionalmente, não foram observadas mudanças na
coloração dos espécimes quando as lâminas foram
reexaminadas através de microscopia após longo período
(três, cinco e nove anos) da montagem. Pelas características
do meio e por ser um meio de montagem temporário,
não foram evidenciados danos a preparação, tampouco
foi visualizada a formação de mofo nas extremidades da
lamínula.
Tabela 1
. Comparação das estruturas após utilização de diferentes corantes e montagem com meio de montagem de
Faure.
Estrutura
Corantes
Tricrômico de
Gomori
Carmim
acético de
Semichon
Hematoxilina
de Delafeld
Eosina
Fast green
Glândulas
cefálicas
+++/-++
Órgãos bucais+++++
Faringe+++-+/-
Esôfago++++/-+/-
Cecos
intestinais
+++++
Átrio genital+++++/-
Testículos++++/-+/-
Vaso/canal
deferente
-----
Ovário+++/---
Vagina+/-+/----
Vitelário+++++
Ducto
vitelínico
+++/---
Ovos+++++
Grampos+++++
Legenda = +: visualização possível; +/-: visualização parcial; -: não visualizado ou de difícil visualização.
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Technique for preparing monogeneans
Neotropical Helminthology (Lima). Vol. 18, N
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Figura 1.
Monogenéticos corados e montados em meio de montagem de Faure: A e B, região anterior e posterior,
respectivamente, de espécimes corados com carmim acético de Semichon; C e D, região anterior e posterior,
respectivamente, de espécimes corados com tricrômico de Gomori; E e F, região anterior e posterior, respectivamente, de
espécimes corados com hematoxilina de Delafeld. Barras = 150 µm
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Neotropical Helminthology (Lima). Vol. 18, N
º
2, jul - dec 2024
Gallas & Fraga da Silveira
Figura 2.
Monogenéticos corados e montados em meio de montagem de Faure: A e B, região anterior e posterior,
respectivamente, de espécimes corados com eosina; C e D, região anterior e posterior, respectivamente, de espécimes
corados com
fast green
. Barras = 150 µm
DISCUSSÃO
O meio de montagem de Faure foi utilizado no presente
estudo pela similaridade ao meio de Hoyer (Eiras
et al
.,
2006; Tatcher, 2006; Amato & Amato, 2010). Os
melhores resultados foram obtidos com os espécimes
a partir de corantes já utilizados para o grupo dos
monogenéticos, como o tricrômico de Gomori (Kritsky
et
al
., 1978; Eiras
et al
., 2006; Tatcher, 2006) e o carmim
acético de Semichon (Gallas
et al
., 2015), um dentre os
tipos de carmins utilizados para corar monogenéticos
(Boudaya
et al
., 2006; Chero
et al
., 2018). Para a
identifcação dos gêneros de monogenéticos, é necessário
observar as estruturas do haptor e sistemas reprodutores
(Yamaguti, 1963), que poderão ser visualizadas nos
espécimes preparados com os corantes supracitados.
Nas montagens realizadas no presente estudo, somente
um pouco do corante foi removido quando os espécimes
foram transferidos para o meio de montagem de Faure,
característica também encontrada quando monogenéticos
são montados pela técnica de Kritsky
et al
. (1978)
(Tatcher, 2006). Nesta pesquisa, a técnica foi realizada
com monogenéticos coletados de peixes marinhos,
portanto a utilização de outros grupos de monogenéticos
requer mais estudo, pois muitos possuem tamanho
diminuto, como é o caso dos monogenéticos parasitos
de peixes de água doce. Devido a composição do meio
de montagem de Faure, os espécimes muito pequenos
podem perder totalmente ou parcialmente o corante
adquirido, limitando a técnica. Além disso, a qualidade
dos espécimes relacionada com o tempo entre a coleta nos
hospedeiros e a fxação dos tecidos, também infuencia na
coloração e montagem.
A técnica apresentada e comparada no presente estudo
constitui em uma alternativa ao uso de substâncias com
restrição de uso. Alguns pesquisadores têm utilizado o
óleo de cravo nas preparações permanentes (Neifar
et
al
., 2000; Bullard
et al
., 2003; Jithendran
et al
., 2005;
Boudaya
et al
., 2006), como alternativa às substâncias
como xileno e creosoto de Faia. Contudo, essas
técnicas ainda requerem uma sequência de etapas de
manipulação dos espécimes em diferentes substâncias,
que podem causar a perda dos monogenéticos (Silveira
& Almeida, 2014), principalmente devido ao tamanho
dos espécimes. Uma vantagem que a técnica adaptada no
presente estudo oferece é evitar a contínua manipulação
supracitada. Outras vantagens incluem a simplicidade
dos componentes utilizados na fórmula e a desnecessária
utilização de equipamentos de laboratório como cabines
de segurança, que devem ser usadas quando os espécimes
são montados com creosoto de Faia (Pritchard & Kruse,
1982; Amato
et al
., 1991; Eiras
et al
., 2006).
As técnicas utilizadas por Kritsky
et al
. (1978), Gallas
et
al
. (2015) e a apresentada neste estudo não substituem os
procedimentos de coloração, diferenciação, desidratação
e clarifcação para a montagem em bálsamo do Canadá
ou outra substância. Estas montagens são realizadas
principalmente ao descrever uma espécie nova, nas
quais alguns espécimes designados como o holótipo e os
parátipos serão depositados em coleções de referência.
A técnica apresentada no presente trabalho constitui
uma alternativa à utilização de substâncias de uso
restrito, principalmente se for possível a montagem de
alguns espécimes de uma infrapopulação numerosa.
Nestas condições, a presente técnica pode evidenciar
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Technique for preparing monogeneans
Neotropical Helminthology (Lima). Vol. 18, N
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determinadas estruturas, permitindo a descrição
morfológica.
AGRADECIMENTO
Ao Tiago S. Sarmento, pela coleta dos monogenéticos
realizada durante o Trabalho de Conclusão de Curso e
que foram utilizados no presente estudo.
Author contributions: CRediT (Contributor Roles
Taxonomy)
MG
= Moisés Gallas
EFS
= Eliane Fraga da Silveira
Conceptualization
: MG, EFS
Data curation
: MG, EFS
Formal Analysis
: MG, EFS
Funding acquisition
: MG, EFS
Investigation
: MG, EFS
Methodology
: MG, EFS
Project administration
: MG, EFS
Resources
: MG, EFS
Software
: MG, EFS
Supervision
: MG, EFS
Validation
: MG, EFS
Visualization
: MG, EFS
Writing – original draft
: MG, EFS
Writing – review & editing
: MG, EFS
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Received September 4, 2024.
Accepted October 11, 2024.