image/svg+xmlEste artículo es publicado por la revista Neotropical Helminthology de la Facultad de Ciencias Naturales y Matemática, Universidad Nacional Federico Villarreal, Lima, Perú auspiciado por la Asociación Peruana de Helmintología e Invertebrados Afines (APHIA). Este es un artículo de acceso abierto, distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Atribución 4.0 Internacional (CC BY 4.0) [https:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/deed.es] que permite el uso, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada de su fuente original.ISSN Versión impresa 2218-6425ISSN Versión Electrónica 1995-1043Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dic:107-122.ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL1Laboratorio de Parasitología y Patología de Organismos Acuáticos, Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia, Argentina. 2Instituto de Investigaciones Biológicas y Biomédicas del Sur, INBIOSUR/UNS-CONICET, Bahía Blanca, Argentina. 3Depto. de Genética y Biología Molecular, IACA Laboratorios, Bahía Blanca. Argentina. *Corresponding author: rtanzola@uns.edu.ar Noelia Adelina Galeano: https://orcid.org/0000-0002-5496-4396Silvia Elizabeth Guagliardo: http://orcid.org/0000-0002-9565-8344Estefanía Tittarelli: https://orcid.org/0000-0002-6882-6621Edgardo Streitenberger: https://orcid.org/0000-0001-6453-9257Ruben Daniel Tanzola: https://orcid.org/0000-0003-4154-306311,233Noelia Adelina Galeano; Silvia Elizabeth Guagliardo; Estefanía Tittarelli; Edgardo Streitenberger & Ruben 1,2*Daniel TanzolaABSTRACTBibliography indicates that the larvae of the genus Contracaecumare of zoonotic importance. These papers are based on a single clinical case whose conclusions are doubtful and should be confirmed. In the present work, the results of experimental infections in Balb/cAnN mice, with L juvenile of the Contracaecum ogmorhini3Johnston & Mawson, 1941 complex, are reported. The helminths were obtained in the stripped weakfish, Cynoscion guatucupa(Cuvier, 1830), the second most important commercial fishery resource in Argentina. The parasites were characterized by morphological and molecular criteria. Their population descriptors were established on a sample of 112 hosts. The potential for migration to the skeletal muscle of the fishes was evaluated and the background on experimental infection of Contracaecumspp. in mammalian hosts is discussed. It is concluded that the third-stage juveniles (L) of the C. ogmorhinicomplex, can cause injury in 3humans only if well defined conditions are met, including that the L migrate naturally to the host's musculature 3(unproven event), that remain viable after gastric digestion by the host and that finds immunological conditions that allow its survival in the digestive tract of the mammal host. Neotropical Helminthology107DOI: http://dx.doi.org/10.24039/rnh20221621481EVALUATION OF THE INVASIVE POTENTIAL OF L JUVENILES OF THE CONTRACAECUM 3OGMORHINIJOHNSTON & MAWSON, 1941 COMPLEX (NEMATODA; ANISAKIDAE) IN AN EXPERIMENTAL MURINE MODELEVALUACIÓN DE LA POTENCIALIDAD INVASORA DE JUVENILES L DEL COMPLEJO 3CONTRACAECUM OGMORHINIJOHNSTON & MAWSON, 1941 (NEMATODA; ANISAKIDAE) EN UN MODELO MURINO EXPERIMENTALDDDDDKeywords: Anisakidosis – Balb/cAnN – Contracaecum– pathogenicityexperimental model art. 1=10-24art. 2=26-41Art 3 =42-51art. 4=52-59art. 5=60-65art 6=66-79art. 7=80-91art 8 =92-100art 9=102-111nota 1=112-116nota 2=118-123 rev =124-134
image/svg+xmlLos antecedentes de la literatura señalan que las larvas del género Contracaecumrevisten importancia zoonótica. Dichos trabajos están basados en un único caso clínico cuyas conclusiones son dudosas y deberían confirmarse. En el presente trabajo se comunican los resultados de ensayos experimentales en ratones Balb/cAnN, infestados con juveniles de tercer estadio (L) del complejo Contracaecum ogmorhini 3Johnston & Mawson, 1941, obtenidas en la pescadilla de red, Cynoscion guatucupa(Cuvier, 1830), segundo recurso pesquero en importancia comercial de Argentina. Los parásitos se caracterizaron por criterios morfológicos y moleculares. Se establecieron sus descriptores poblaciones sobre una muestra de 112 hospedadores. Se evaluó el potencial de migración al músculo esquelético de la pescadilla. Se discuten los antecedentes sobre infestación experimental de Contracaecumspp. en hospedadores mamíferos. Se concluye que los juveniles de tercer estadio (L) del complejo C. ogmorhini parásitos de la 3pescadilla de red pueden provocar lesión en el humano solo si se cumplen condiciones muy definidas, entre ellas que las L migren de modo natural a la musculatura del hospedador (evento no comprobado), 3que permanezcan viables tras la digestión estomacal del hospedador, que encuentre condiciones inmunológicas que permitan su sobrevida en el tubo digestivo del mamífero hospedador.108Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dicRESUMENPalabras clave: Anisakidosis – Balb/cAnN – Contracaecum– Modelo experimental – PatogenicidadGaleano et al.INTRODUCCIÓNLos productos de la pesca a nivel mundial, ocupan un lugar primordial en la alimentación humana como aporte de proteína (Sakanari et al., 1995). Sin embargo, las malas prácticas de higiene de los alimentos suponen un riesgo en salud pública. La presencia de parásitos en el pescado es un fenómeno generalizado e imposible de eliminar de las poblaciones silvestres, porque los factores ecológicos que determinan las infecciones parasitarias, escapan del control humano. Entre las enfermedades zoonóticas transmitidas por alimentos se destaca la anisakidosis, debida al consumo de peces y cefalópodos crudos (Ishikura et al., 1993). Los agentes etiológicos son nematodes de la familia Anisakidae, entre los que la literatura mundial reconoce principalmente larvas pertenecientes a los géneros Anisakis Dujardin, 1845;PseudoterranovaMozgovoi, 1951, y en menor gradoContracaecum Raillet & Henry, 1912 e Hysterothylacium Ward & Magath, 1916(Oshima, 1972; Jackson, 1975; Norris & Overstreet, 1976; Oshima, 1987; Yagi et al., 1996; Audicana et al., 2002; Audicana & Kennedy, 2008; Degese et al., 2019; Morozinska-Gogol, 2019). La mayoría de las citas sobre anisakidosis por Contracaecumspp. están basadas en un caso humano por larvas de ContracaecumosculatumRudolphi, 1802 en el mar Báltico (Schaum & Müller, 1967). Este antecedente ha sido referido en numerosas publicaciones posteriores (Myers, 1975; Acha & Szyfres, 1977; Cheng, 1978; Sakanari & McKerrow, 1989, Angot & Brasseur, 1993; Myjak et al., 1994; Field-Cortazares & Calderón-Campos, 2009). Sin embargo, de la lectura de Schaum & Müller (op. cit.), así como por el grado de deterioro del espécimen en sus cortes histológicos, no es posible confirmar que se trate de larvas de Contracaecumni mucho menos de la especie C. osculatum. De hecho, podría tratarse también de larvas de Anisakissp. o de Pseudoterranovasp.(Petter, 1969; Shiraki, 1974). Angot & Brasseur (1995) opinan que dado que las larvas de Contracaecumspp. en peces, parasitan los mesenterios y cavidad visceral, y su localización muscular es accidental, “su patogenicidad, en humanos, queda por ser demostrada”. Sumado a esto, durante mucho tiempo, los trabajos de migración larvaria en mamíferos destacaron los ensayos experimentales de Cheng (1976) con larvas de Contracaecumspp. No obstante, la descripción morfológica y la presencia de L y adultos en el mismo hospedador 4(Gadus callariasLinnaeus, 1758), indican que claramente pertenecerían al género Hysterothylacium. Lo cierto es que, hasta el presente, los eventos que imputan al género Contracaecumcomo agente causal de anisakidosis son escasos e imprecisos (Menghi et al., 2011; art. 1=10-24art. 2=26-41Art 3 =42-51art. 4=52-59art. 5=60-65art 6=66-79art. 7=80-91art 8 =92-100art 9=102-111nota 1=112-116nota 2=118-123 rev =124-134
image/svg+xml109Shamsi & Butcher, 2011). Kliks (1983), con el término “anisakiasis transitoria”, designó una forma benigna, con expulsión por vía oral de larvas de Pseudoterranovasp. y de Anisakissp. Tal podría ser el caso de los citados reportes de Contracaecumsp. en humanos. Procurando esclarecer su potencial invasor, en el presente trabajo se comunican los resultados de ensayos experimentales en ratones, infestados con larvas L 3del complejo Contracaecum ogmorhini, Johnston & Mawson, 1941 obtenidas en la pescadilla de red, Cynoscion guatucupa (Cuvier, 1830) (Perciformes: Sciaenidae). Ruarte et al. (2004) señalan que la pescadilla de red es el segundo recurso en importancia comercial de Argentina, por tal motivo se ha elegido este hospedador.Toma y análisis de muestrasFueron procesados 112 ejemplares adultos de C. guatucupa capturados entre 2009 y 2011 por la flota pesquera comercial que opera en el estuario de Bahía Blanca (38º44' S y 61º45' O), Argentina. Se evisceraron completamente antes de transcurridas ocho h post-captura. Se registraron la talla y el peso (total y eviscerado) en cm y g, respectivamente. Se examinaron macroscópicamente la superficie cutánea, branquial y oral; las vísceras dispuestas en la cavidad celómica y mesenterios.Los nematodos recolectados se fijaron y conservaron en etanol 70º, para estudios morfológicos, y etanol 96°, para estudios moleculares. Se calcularon los indicadores parasitarios prevalencia (P), intensidad media (IM) y abundancia media (AM), según Bush et al.(1997). Los valores de abundancia e intensidad se indican como el promedio y, entre paréntesis, el rango o amplitud y el error estándar de la media. Las medidas de los caracteres morfológicos están expresadas en milímetros (mm) como el promedio y el rango entre paréntesis, salvo que se indique otra unidad.Se hallan depositados 12 especímenes L voucher, 3conservados en alcohol etílico al 70%, en la colección de Helmintos de la División Zoología Invertebrados del Museo de La Plata bajo el número MLp- He 7769.Identificación molecular La obtención de ADN se realizó a partir de digestión enzimática de las larvas. Se colocaron las larvas en 200µL de solución fisiológica, se agregó igual volumen de MagnaPure DNA Tissue Lysis buffer (Roche®) y 20µL de proteinasa K. La mezcla fue incubada durante 30 minutos a 56ºC. Para inactivar la proteinasa K, la muestra fue sometida a 95ºC por 10 min. Luego, el ADN se purificó utilizando un sistema automatizado MagnaPure Compact (Roche®), con un volumen final de elución de 50µL. Mediante el empleo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se amplificaron 4 segmentos del genoma: un fragmento de 519 pb correspondiente al gen de la citocromo oxidasa 2 mitocondrial (COX-2). Se emplearon los siguientes primers: El gen COX 2 fue amplificado con los primers 211F 5´-TTT TCT AGT TAT ATA GAT TGR TTY AT-3´ y 210 R 5´-CAC CAA CTC TTA AAA TTA TC-3´ de acuerdo a los procedimientos descriptos por Garbin et al. (2011). La amplificación se llevó a cabo usando el Kit HotStarTaq PlusMaster Mix (QIAGEN®), con una concentración final de la master mix de 1 X, 0,5-5 ng de ADN y 0,5 µM de cada uno de los primers, en un volumen final de 25 µL. La PCR se realizó en un termociclador Veriti (Applied Biosystems®) usando los siguientes parámetros de ciclado: 95◦C 10 min, 34 ciclos de 95◦C 30 s, 46◦C 60s y 72◦C 90s, y una extensión final de 72◦C por 10 min. Los productos de PCR se corrieron en un gel de agarosa al 2% para verificar la efectividad de la amplificación. Las bandas se visualizaron por tinción con bromuro de etidio utilizando luz UV. Finalmente, los productos fueron purificados con el kit de purificación PCR QIAquick (Qiagen®) y cuantificados con un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Thermo Scientific®). El producto de PCR purificado se secuenció en ambos sentidos usando el kit BigDye Terminator v.1.1 de Applied Biosystem® en un volumen final de 20 µL, con una dilución de la master mix de 0,125X, 1µM de cada primer y 15 ng de producto de PCR. Los parámetros de ciclado fueron: 96◦C 1 min, 30 ciclos de 96◦C 10 s, 50◦C 5 s y 60◦C 4 min. Los productos de secuenciación se corrieron en un secuenciador automático ABI 3500 de Applied Biosystem® y se analizaron mediante el programa Sequencing Analysis v5,4. Para analizar las relaciones filogenéticas, se buscaron secuencias del gen COX-2 depositadas MATERIALES Y MÉTODOSNeotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dicInvasive potential of L juveniles of Contracaecum ogmorhini3art. 1=10-24art. 2=26-41Art 3 =42-51art. 4=52-59art. 5=60-65art 6=66-79art. 7=80-91art 8 =92-100art 9=102-111nota 1=112-116nota 2=118-123 rev =124-134
image/svg+xml110en la base de datos GenBank (NCBI). Se realizaron dos alineamientos distintos, uno general (44 secuencias) con el objetivo de visualizar la asociación entre la secuencia de la especie en estudio y las secuencias encontradas en GenBank. En un segundo alineamiento, más reducido (11 secuencias), se estudiaron asociaciones entre la secuencia en estudio y aquellas correspondientes a hospedadores mamíferos. Posteriormente, se alinearon las secuencias mediante el programa Muscle. Se utilizó el programa Jmodel Test para evaluar el modelo evolutivo que mejor aplicaba a nuestro alineamiento (Darriba et al., 2012). Se realizaron los análisis filogenéticos aplicando distintos métodos: distancia o Neighbor-Joining (NJ) (Saitou & Nei, 1987), Máxima parsimonia (MP) a través del programa MEGA v.5.2 (Tamura et al., 2011) y bayesianos (MrBayes software v.3.2.6 ([Ronquist & Huelsenbeck, 2003]). El soporte de las ramas para el método de NJ y MP, se evaluó mediante 1.000 repeticiones de boostrap, considerando una rama confiable aquella con un valor mayor al 70 %. Para MP se realizó consenso estricto (el 100% de los árboles más parsimoniosos encontrados presentan esa topología de ramas) y consenso mayoría (lo mismo, pero en el 50% o más de los árboles). En la metodología bayesiana donde se implementó la cadena de Markov de Monte Carlo (MCMC), la convergencia de la misma se evaluó considerando un desvío estándar en las frecuencias de los clados menor a 0,01 y valores de población efectiva (ESS) mayor a 200. Valores que se verificaron utilizando el programa Tracer v.1.5. Los resultados de las estimaciones de árboles se resumieron descartando el 10% de los árboles que se guardaron. El soporte de las ramas, en este método, fue evaluado mediante probabilidad a posteriori, considerando una rama confiable aquella con un valor mayor a 0,7. La visualización de los árboles obtenidos se realizó mediante el software FigTree v.1.4.2. La secuencia de consenso obtenida (556 bp) fue depositada en GenBank bajo el número de acceso On854976.Digestión enzimática del músculo estriado de C. guatucupaCon el fin de comprobar la migración de las larvas desde la cavidad corporal hacia el músculo se tomaron muestras de musculatura ventral, dorsal y lateral de los peces en cuestión. Se procedió a su digestión enzimática artificial. La solución digestora consistió en: solución salina de ácido clorhídrico (pH=1-2) con 10 g de Pepsina (riqueza 1:10.000) por L de solución salina. En un vaso de precipitado se introdujo la muestra de filete y la solución para digestión, en una proporción 1:2, respectivamente. Se incubó en baño termostático a una temperatura de 37º C por un período de cinco horas, se agitó con varilla de vidrio. El líquido resultante se observó bajo lupa estereoscópica.Infestación en modelo murinoSe recolectaron larvas de Contracaecum sp. de la cavidad corporal de los peces. Se utilizaron para la infestación dos cepas de ratones, Balb/cAnN y CF1 de dos meses de vida y con un peso de aproximadamente 25 g. Los animales fueron mantenidos en el Bioterio del Depto. de Biología, Bioquímica y Farmacia bajo condiciones de temperatura controlada, entre 20 – 25ºC, con periodos de 12 horas luz/12 horas oscuridad. Las larvas fueron introducidas en el estómago de los ratones con una cánula de 15G que se encontraba sujeta a una jeringa de 5 mL y/o con pipeta plástica. Realizada la inoculación de las larvas se observó la materia fecal de los ratones durante las 24 h post-inoculación (PI).Transcurrido el tiempo de infestación los ratones fueron sacrificados humanamente siguiendo los protocolos para la protección de los animales usados para la experimentación (UE 2010). Se disecó y observó bajo lupa estereoscópica el tubo digestivo de cada animal en toda su extensión para localizar la posible inserción de larvas. Como técnicas histológicas de rutina, los órganos fueron fijados en formalina 10% y en glutaraldehído 2,5% (en frío, para ser estudiados con microscopio electrónico de barrido) (Marca EVO 40 perteneciente al CCT/CONICET Bahía Blanca). El material fijado en glutaraldehído 2,5%, fue lavado en buffer y se procedió a la deshidratación en acetonas de 35º, 50º, 70º, 80º, 100º. Se realizó secado por punto crítico (Marca Polaroid) y posteriormente se metalizó con oro (Sputter coater, Pelco® 91000, 300 Å). Para el análisis histopatológico se realizaron cortes a 5 µm teñidos con hematoxilina y eosina y tricrómico de Masson.Aspectos éticos: Los autores señalan que se Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dicGaleano et al.art. 1=10-24art. 2=26-41Art 3 =42-51art. 4=52-59art. 5=60-65art 6=66-79art. 7=80-91art 8 =92-100art 9=102-111nota 1=112-116nota 2=118-123 rev =124-134
image/svg+xml111cumplieron las normativas éticas nacionales e internacionales.Identificación morfológica y molecular del parásito Se examinaron 112 ejemplares (33 hembras, 60 machos y 19 individuos de sexo indeterminado) de C. guatucupa,cuyas talla y peso totales fueron 45,31 (25,7-53,2) cm y 792,94 (415-1.496) g, respectivamente. En ellos se encontró un total de 499 larvas identificadas morfológicamente a prioricomo Contracaecumsp. El 84,6% estaba asociado a los mesenterios y 15,4% libres en la cavidad celómica, con una prevalencia de 57,1%, abundancia media de 4,44 (0-9; 2,63) e intensidad promedio de 7,78 (1-12; 3,15).Descripción del parásito (n= 20) Contracaecumsp. L3Los ejemplares fueron hallados libres o asociados RESULTADOS Figura 1.a) ContracaecumL del complejo C. ogmorhini(in toto) de la cavidad visceral de C.guatucupa. Barra= 0,2 mm. b) 3Extremo anterior de la L señalando el diente perforante (D) y ubicación del poro excretor (*). Barra= 0,05 mm. c) Detalle del 3apéndice ventricular (AV) y del ciego Intestinal (CI) de la L. Barra= 0,10 mm. d) Detalle del extremo caudal de la L. Barra= 0,05 33mmNeotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dicInvasive potential of L juveniles of Contracaecum ogmorhini3art. 1=10-24art. 2=26-41Art 3 =42-51art. 4=52-59art. 5=60-65art 6=66-79art. 7=80-91art 8 =92-100art 9=102-111nota 1=112-116nota 2=118-123 rev =124-134
image/svg+xml112con otras formas parásitas en la cavidad celómica del hospedador en los mesenterios (Fig. 1a). Poseen una cutícula estriada transversalmente, con diminutas crestas longitudinales que recorren el cuerpo hasta la cola (Figs. 1b y 2). La longitud promedio de las larvas fue de 3,53 (2,72-4,65), con un ancho máximo de 0,130 (0,080-0,200). La boca está rodeada por tres primordios labiales y es notorio un diente larval, entre la posición de los futuros labios ventrolaterales y por delante del poro excretor. Poro excretor anterior e interlabial se ubica con respecto al extremo anterior a una distancia promedio de 0,015 (0,01-0,017). Ánfidos e interlabios no visibles. El anillo nervioso se encuentra a 0,185 (0,150-0,250) del extremo anterior. El esófago mide 0,44 (0,26-0,66) (Fig. 1c). El apéndice ventricular de 0,39 (0,3-0,66) de longitud promedio, se proyecta hacia la parte posterior desde el esófago. Ciego intestinal de 0,233 (0,15-0,39). Cola estriada, cónica y mide 0,10 (0,08-0,19). Fásmidos no visibles. No posee mucrón terminal (Fig. 1d). Histología larval: Se observó en la superficie externa la cutícula, una capa homogénea de tonalidad rosada refringente que presenta una ornamentación externa dispuesta en pequeñas crestas longitudinales (Fig. 2). El espesor cuticular es de un promedio de 5,36 (3-6,73) µm. La relación de proporción con respecto al diámetro corporal en determinados niveles indica que no sigue un patrón de grosor uniforme, ocurriendo zonas con la cutícula adelgazada, en general la proporción ronda 1:15 y 1:16. No presenta alas laterales. Los cordones hipodérmicos corren longitudinalmente y dividen la musculatura somática en cuatro cuadrantes, siendo el dorsal y ventral de menor desarrollo que los laterales. Cada cuadrante está constituido por aproximadamente 14 células musculares (contadas a nivel del núcleo de la glándula excretora). El sistema excretor está formado por una glándula unicelular gigante en forma de cinta que corre longitudinalmente adherida al lóbulo ventral del cordón lateral izquierdo. Identificación molecular de las larvas de Contracaecumobtenidas en C. guatucupaLas secuencias del gen mitocondrial de ADN COX 2 de larvas de Contracaecumsp. halladas en la pescadilla de red fueron comparadas con las siguientes secuencias disponibles del género Contracaecumdepositadas en GenBank: EU477207.1 Contracaecumcf. osculatumD, EU477205.1 C.cf. osculatumE, EU477204.1 C. cf. osculatumB, EU477203.1 Contracaecumcf. osculatumA, EU477208.1 C. osculatum baicalensis, EU477210.1, C. radiatum,