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Este artículo es publicado por la revista Neotropical Helminthology de la Facultad de Ciencias Naturales y Matemática, Universidad Nacional
Federico Villarreal, Lima, Perú auspiciado por la Asociación Peruana de Helmintología e Invertebrados Afines (APHIA). Este es un artículo de
acceso abierto, distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Atribución 4.0 Internacional (CC BY 4.0) [https://
creativecommons.org/licenses/by/4.0/deed.es] que permite el uso, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original
sea debidamente citada de su fuente original.
ISSN Versión impresa 2218-6425
ISSN Versión Electrónica 1995-1043
Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dic:107-122.
ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL
1
Laboratorio de Parasitología y Patología de Organismos Acuáticos, Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia,
Argentina.
2
Instituto de Investigaciones Biológicas y Biomédicas del Sur, INBIOSUR/UNS-CONICET, Bahía Blanca, Argentina.
3
Depto. de Genética y Biología Molecular, IACA Laboratorios, Bahía Blanca. Argentina.
*Corresponding author: rtanzola@uns.edu.ar
Noelia Adelina Galeano: https://orcid.org/0000-0002-5496-4396
Silvia Elizabeth Guagliardo: http://orcid.org/0000-0002-9565-8344
Estefanía Tittarelli: https://orcid.org/0000-0002-6882-6621
Edgardo Streitenberger: https://orcid.org/0000-0001-6453-9257
Ruben Daniel Tanzola: https://orcid.org/0000-0003-4154-3063
11,233
Noelia Adelina Galeano; Silvia Elizabeth Guagliardo; Estefanía Tittarelli; Edgardo Streitenberger & Ruben
1,2*
Daniel Tanzola
ABSTRACT
Bibliography indicates that the larvae of the genus
Contracaecum
are of zoonotic importance. These papers are
based on a single clinical case whose conclusions are doubtful and should be confirmed. In the present work,
the results of experimental infections in Balb/cAnN mice, with L juvenile of the
Contracaecum ogmorhini
3
Johnston & Mawson, 1941 complex, are reported. The helminths were obtained in the stripped weakfish,
Cynoscion guatucupa
(Cuvier, 1830), the second most important commercial fishery resource in Argentina.
The parasites were characterized by morphological and molecular criteria. Their population descriptors were
established on a sample of 112 hosts. The potential for migration to the skeletal muscle of the fishes was
evaluated and the background on experimental infection of
Contracaecum
spp. in mammalian hosts is
discussed. It is concluded that the third-stage juveniles (L) of the
C. ogmorhini
complex, can cause injury in
3
humans only if well defined conditions are met, including that the L migrate naturally to the host's musculature
3
(unproven event), that remain viable after gastric digestion by the host and that finds immunological conditions
that allow its survival in the digestive tract of the mammal host.
Neotropical Helminthology
107
DOI: http://dx.doi.org/10.24039/rnh20221621481
EVALUATION OF THE INVASIVE POTENTIAL OF L JUVENILES OF THE
CONTRACAECUM
3
OGMORHINI
JOHNSTON & MAWSON, 1941 COMPLEX (NEMATODA; ANISAKIDAE) IN AN
EXPERIMENTAL MURINE MODEL
EVALUACIÓN DE LA POTENCIALIDAD INVASORA DE JUVENILES L DEL COMPLEJO
3
CONTRACAECUM OGMORHINI
JOHNSTON & MAWSON, 1941 (NEMATODA; ANISAKIDAE) EN
UN MODELO MURINO EXPERIMENTAL
D
D
D
D
D
Keywords
: Anisakidosis – Balb/cAnN –
Contracaecum
– pathogenicity
–
experimental model
art. 1=10-24
art. 2=26-41
Art 3 =42-51
art. 4=52-59
art. 5=60-65
art 6=66-79
art. 7=80-91
art 8 =92-100
art 9=102-111
nota 1=112-116
nota 2=118-123
rev =124-134
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Los antecedentes de la literatura señalan que las larvas del género
Contracaecum
revisten importancia
zoonótica. Dichos trabajos están basados en un único caso clínico cuyas conclusiones son dudosas y
deberían confirmarse. En el presente trabajo se comunican los resultados de ensayos experimentales en
ratones Balb/cAnN, infestados con juveniles de tercer estadio (L) del complejo
Contracaecum ogmorhini
3
Johnston & Mawson, 1941, obtenidas en la pescadilla de red,
Cynoscion guatucupa
(Cuvier, 1830),
segundo recurso pesquero en importancia comercial de Argentina. Los parásitos se caracterizaron por
criterios morfológicos y moleculares. Se establecieron sus descriptores poblaciones sobre una muestra de
112 hospedadores. Se evaluó el potencial de migración al músculo esquelético de la pescadilla. Se
discuten los antecedentes sobre infestación experimental de
Contracaecum
spp. en hospedadores
mamíferos. Se concluye que los juveniles de tercer estadio (L) del complejo
C. ogmorhini
parásitos de la
3
pescadilla de red pueden provocar lesión en el humano solo si se cumplen condiciones muy definidas,
entre ellas que las L migren de modo natural a la musculatura del hospedador (evento no comprobado),
3
que permanezcan viables tras la digestión estomacal del hospedador, que encuentre condiciones
inmunológicas que permitan su sobrevida en el tubo digestivo del mamífero hospedador.
108
Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dic
RESUMEN
Palabras clave
: Anisakidosis – Balb/cAnN –
Contracaecum
– Modelo experimental – Patogenicidad
Galeano
et al.
INTRODUCCIÓN
Los productos de la pesca a nivel mundial, ocupan
un lugar primordial en la alimentación humana
como aporte de proteína (Sakanari
et al
., 1995). Sin
embargo, las malas prácticas de higiene de los
alimentos suponen un riesgo en salud pública. La
presencia de parásitos en el pescado es un
fenómeno generalizado e imposible de eliminar de
las poblaciones silvestres, porque los factores
ecológicos que determinan las infecciones
parasitarias, escapan del control humano. Entre las
enfermedades zoonóticas transmitidas por
alimentos se destaca la anisakidosis, debida al
consumo de peces y cefalópodos crudos (Ishikura
et al
., 1993). Los agentes etiológicos son
nematodes de la familia Anisakidae, entre los que
la literatura mundial reconoce principalmente
larvas pertenecientes a los géneros
Anisakis
Dujardin, 1845;
Pseudoterranova
Mozgovoi,
1951, y en menor grado
Contracaecum
Raillet &
Henry, 1912 e
Hysterothylacium
Ward & Magath,
1916
(Oshima, 1972; Jackson, 1975; Norris &
Overstreet, 1976; Oshima, 1987; Yagi
et al
., 1996;
Audicana
et al
., 2002; Audicana & Kennedy, 2008;
Degese
et al
., 2019; Morozinska-Gogol, 2019).
La mayoría de las citas sobre anisakidosis por
Contracaecum
spp. están basadas en un caso
humano por larvas de
Contracaecum
osculatum
Rudolphi, 1802 en el mar Báltico (Schaum &
Müller, 1967). Este antecedente ha sido referido en
numerosas publicaciones posteriores (Myers,
1975; Acha & Szyfres, 1977; Cheng, 1978;
Sakanari & McKerrow, 1989, Angot & Brasseur,
1993; Myjak
et al
., 1994; Field-Cortazares &
Calderón-Campos, 2009). Sin embargo, de la
lectura de Schaum & Müller (
op. cit
.), así como por
el grado de deterioro del espécimen en sus cortes
histológicos, no es posible confirmar que se trate de
larvas de
Contracaecum
ni mucho menos de la
especie
C. osculatum
. De hecho, podría tratarse
también de larvas de
Anisakis
sp. o de
Pseudoterranova
sp.
(Petter, 1969; Shiraki, 1974).
Angot & Brasseur (1995) opinan que dado que las
larvas de
Contracaecum
spp. en peces, parasitan
los mesenterios y cavidad visceral, y su
localización muscular es accidental, “su
patogenicidad, en humanos, queda por ser
demostrada”. Sumado a esto, durante mucho
tiempo, los trabajos de migración larvaria en
mamíferos destacaron los ensayos experimentales
de Cheng (1976) con larvas de
Contracaecum
spp.
No obstante, la descripción morfológica y la
presencia de L y adultos en el mismo hospedador
4
(
Gadus callarias
Linnaeus, 1758), indican que
claramente pertenecerían al género
Hysterothylacium.
Lo cierto es que, hasta el
presente, los eventos que imputan al género
Contracaecum
como agente causal de anisakidosis
son escasos e imprecisos (Menghi
et al
., 2011;
art. 1=10-24
art. 2=26-41
Art 3 =42-51
art. 4=52-59
art. 5=60-65
art 6=66-79
art. 7=80-91
art 8 =92-100
art 9=102-111
nota 1=112-116
nota 2=118-123
rev =124-134
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109
Shamsi & Butcher, 2011). Kliks (1983), con el
término “anisakiasis transitoria”, designó una
forma benigna, con expulsión por vía oral de larvas
de
Pseudoterranova
sp. y de
Anisakis
sp. Tal podría
ser el caso de los citados reportes de
Contracaecum
sp. en humanos. Procurando esclarecer su
potencial invasor, en el presente trabajo se
comunican los resultados de ensayos
experimentales en ratones, infestados con larvas L
3
del complejo
Contracaecum ogmorhini
, Johnston
& Mawson, 1941 obtenidas en la pescadilla de red,
Cynoscion guatucupa
(Cuvier, 1830)
(Perciformes: Sciaenidae). Ruarte
et al
. (2004)
señalan que la pescadilla de red es el segundo
recurso en importancia comercial de Argentina, por
tal motivo se ha elegido este hospedador.
Toma y análisis de muestras
Fueron procesados 112 ejemplares adultos de
C.
guatucupa
capturados entre 2009 y 2011 por la
flota pesquera comercial que opera en el estuario de
Bahía Blanca (38º44' S y 61º45' O), Argentina. Se
evisceraron completamente antes de transcurridas
ocho h post-captura. Se registraron la talla y el peso
(total y eviscerado) en cm y g, respectivamente. Se
examinaron macroscópicamente la superficie
cutánea, branquial y oral; las vísceras dispuestas en
la cavidad celómica y mesenterios.Los nematodos
recolectados se fijaron y conservaron en etanol 70º,
para estudios morfológicos, y etanol 96°, para
estudios moleculares. Se calcularon los
indicadores parasitarios prevalencia (P),
intensidad media (IM) y abundancia media (AM),
según Bush
et al.
(1997). Los valores de
abundancia e intensidad se indican como el
promedio y, entre paréntesis, el rango o amplitud y
el error estándar de la media. Las medidas de los
caracteres morfológicos están expresadas en
milímetros (mm) como el promedio y el rango
entre paréntesis, salvo que se indique otra unidad.
Se hallan depositados 12 especímenes L voucher,
3
conservados en alcohol etílico al 70%, en la
colección de Helmintos de la División Zoología
Invertebrados del Museo de La Plata bajo el
número MLp- He 7769.
Identificación molecular
La obtención de ADN se realizó a partir de
digestión enzimática de las larvas. Se colocaron las
larvas en 200µL de solución fisiológica, se agregó
igual volumen de MagnaPure DNA Tissue Lysis
buffer (Roche®) y 20µL de proteinasa K. La
mezcla fue incubada durante 30 minutos a 56ºC.
Para inactivar la proteinasa K, la muestra fue
sometida a 95ºC por 10 min. Luego, el ADN se
purificó utilizando un sistema automatizado
MagnaPure Compact (Roche®), con un volumen
final de elución de 50µL. Mediante el empleo de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se
amplificaron 4 segmentos del genoma: un
fragmento de 519 pb correspondiente al gen de la
citocromo oxidasa 2 mitocondrial (COX-2). Se
emplearon los siguientes primers: El gen COX 2
fue amplificado con los primers 211F 5´-TTT TCT
AGT TAT ATA GAT TGR TTY AT-3´ y 210 R 5´-
CAC CAA CTC TTA AAA TTA TC-3´ de acuerdo
a los procedimientos descriptos por Garbin
et al
.
(2011). La amplificación se llevó a cabo usando el
Kit HotStarTaq PlusMaster Mix (QIAGEN®), con
una concentración final de la master mix de 1 X,
0,5-5 ng de ADN y 0,5 µM de cada uno de los
primers, en un volumen final de 25 µL. La PCR se
realizó en un termociclador Veriti (Applied
Biosystems®) usando los siguientes parámetros de
ciclado: 95◦C 10 min, 34 ciclos de 95◦C 30 s, 46◦C
60s y 72◦C 90s, y una extensión final de 72◦C por
10 min. Los productos de PCR se corrieron en un
gel de agarosa al 2% para verificar la efectividad de
la amplificación. Las bandas se visualizaron por
tinción con bromuro de etidio utilizando luz UV.
Finalmente, los productos fueron purificados con
el kit de purificación PCR QIAquick (Qiagen®) y
cuantificados con un espectrofotómetro NanoDrop
1000 (Thermo Scientific®). El producto de PCR
purificado se secuenció en ambos sentidos usando
el kit BigDye Terminator v.1.1 de Applied
Biosystem® en un volumen final de 20 µL, con una
dilución de la master mix de 0,125X, 1µM de cada
primer y 15 ng de producto de PCR. Los
parámetros de ciclado fueron: 96◦C 1 min, 30
ciclos de 96◦C 10 s, 50◦C 5 s y 60◦C 4 min. Los
productos de secuenciación se corrieron en un
secuenciador automático ABI 3500 de Applied
Biosystem® y se analizaron mediante el programa
Sequencing Analysis v5,4.
Para analizar las relaciones filogenéticas, se
buscaron secuencias del gen COX-2 depositadas
MATERIALES Y MÉTODOS
Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dic
Invasive potential of L juveniles of
Contracaecum ogmorhini
3
art. 1=10-24
art. 2=26-41
Art 3 =42-51
art. 4=52-59
art. 5=60-65
art 6=66-79
art. 7=80-91
art 8 =92-100
art 9=102-111
nota 1=112-116
nota 2=118-123
rev =124-134
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110
en la base de datos GenBank (NCBI). Se realizaron
dos alineamientos distintos, uno general (44
secuencias) con el objetivo de visualizar la
asociación entre la secuencia de la especie en
estudio y las secuencias encontradas en GenBank.
En un segundo alineamiento, más reducido (11
secuencias), se estudiaron asociaciones entre la
secuencia en estudio y aquellas correspondientes a
hospedadores mamíferos. Posteriormente, se
alinearon las secuencias mediante el programa
Muscle. Se utilizó el programa Jmodel Test para
evaluar el modelo evolutivo que mejor aplicaba a
nuestro alineamiento (Darriba
et al.
, 2012). Se
realizaron los análisis filogenéticos aplicando
distintos métodos: distancia o Neighbor-Joining
(NJ) (Saitou & Nei, 1987), Máxima parsimonia
(MP) a través del programa MEGA v.5.2 (Tamura
et al
., 2011) y bayesianos (MrBayes software
v.3.2.6 ([Ronquist & Huelsenbeck, 2003]). El
soporte de las ramas para el método de NJ y MP, se
evaluó mediante 1.000 repeticiones de boostrap,
considerando una rama confiable aquella con un
valor mayor al 70 %. Para MP se realizó consenso
estricto (el 100% de los árboles más parsimoniosos
encontrados presentan esa topología de ramas) y
consenso mayoría (lo mismo, pero en el 50% o más
de los árboles). En la metodología bayesiana donde
se implementó la cadena de Markov de Monte
Carlo (MCMC), la convergencia de la misma se
evaluó considerando un desvío estándar en las
frecuencias de los clados menor a 0,01 y valores de
población efectiva (ESS) mayor a 200. Valores que
se verificaron utilizando el programa Tracer v.1.5.
Los resultados de las estimaciones de árboles se
resumieron descartando el 10% de los árboles que
se guardaron. El soporte de las ramas, en este
método, fue evaluado mediante probabilidad
a
posteriori
, considerando una rama confiable
aquella con un valor mayor a 0,7. La visualización
de los árboles obtenidos se realizó mediante el
software FigTree v.1.4.2.
La secuencia de consenso obtenida (556 bp) fue
depositada en GenBank bajo el número de acceso
On854976.
Digestión enzimática del músculo estriado de
C.
guatucupa
Con el fin de comprobar la migración de las larvas
desde la cavidad corporal hacia el músculo se
tomaron muestras de musculatura ventral, dorsal y
lateral de los peces en cuestión. Se procedió a su
digestión enzimática artificial. La solución
digestora consistió en: solución salina de ácido
clorhídrico (pH=1-2) con 10 g de Pepsina (riqueza
1:10.000) por L de solución salina. En un vaso de
precipitado se introdujo la muestra de filete y la
solución para digestión, en una proporción 1:2,
respectivamente. Se incubó en baño termostático a
una temperatura de 37º C por un período de cinco
horas, se agitó con varilla de vidrio. El líquido
resultante se observó bajo lupa estereoscópica.
Infestación en modelo murino
Se recolectaron larvas de
Contracaecum
sp. de la
cavidad corporal de los peces. Se utilizaron para la
infestación dos cepas de ratones, Balb/cAnN y CF1
de dos meses de vida y con un peso de
aproximadamente 25 g. Los animales fueron
mantenidos en el Bioterio del Depto. de Biología,
Bioquímica y Farmacia bajo condiciones de
temperatura controlada, entre 20 – 25ºC, con
periodos de 12 horas luz/12 horas oscuridad. Las
larvas fueron introducidas en el estómago de los
ratones con una cánula de 15G que se encontraba
sujeta a una jeringa de 5 mL y/o con pipeta plástica.
Realizada la inoculación de las larvas se observó la
materia fecal de los ratones durante las 24 h post-
inoculación (PI).
Transcurrido el tiempo de infestación los ratones
fueron sacrificados humanamente siguiendo los
protocolos para la protección de los animales
usados para la experimentación (UE 2010). Se
disecó y observó bajo lupa estereoscópica el tubo
digestivo de cada animal en toda su extensión para
localizar la posible inserción de larvas. Como
técnicas histológicas de rutina, los órganos fueron
fijados en formalina 10% y en glutaraldehído 2,5%
(en frío, para ser estudiados con microscopio
electrónico de barrido) (Marca EVO 40
perteneciente al CCT/CONICET Bahía Blanca). El
material fijado en glutaraldehído 2,5%, fue lavado
en buffer y se procedió a la deshidratación en
acetonas de 35º, 50º, 70º, 80º, 100º. Se realizó
secado por punto crítico (Marca Polaroid) y
posteriormente se metalizó con oro (Sputter coater,
Pelco® 91000, 300 Å).
Para el análisis histopatológico se realizaron cortes
a 5 µm teñidos con hematoxilina y eosina y
tricrómico de Masson.
Aspectos éticos
: Los autores señalan que se
Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dic
Galeano
et al.
art. 1=10-24
art. 2=26-41
Art 3 =42-51
art. 4=52-59
art. 5=60-65
art 6=66-79
art. 7=80-91
art 8 =92-100
art 9=102-111
nota 1=112-116
nota 2=118-123
rev =124-134
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111
cumplieron las normativas éticas nacionales e
internacionales.
Identificación morfológica y molecular del
parásito
Se examinaron 112 ejemplares (33 hembras, 60
machos y 19 individuos de sexo indeterminado) de
C. guatucupa,
cuyas talla y peso totales fueron
45,31 (25,7-53,2) cm y 792,94 (415-1.496) g,
respectivamente. En ellos se encontró un total de
499 larvas identificadas morfológicamente
a priori
como
Contracaecum
sp. El 84,6% estaba asociado
a los mesenterios y 15,4% libres en la cavidad
celómica, con una prevalencia de 57,1%,
abundancia media de 4,44 (0-9; 2,63) e intensidad
promedio de 7,78 (1-12; 3,15).
Descripción del parásito (n= 20)
Contracaecum
sp. L
3
Los ejemplares fueron hallados libres o asociados
RESULTADOS
Figura 1.
a)
Contracaecum
L del complejo
C. ogmorhini
(
in toto
) de la cavidad visceral de
C.
guatucupa
. Barra= 0,2 mm. b)
3
Extremo anterior de la L señalando el diente perforante (D) y ubicación del poro excretor (*). Barra= 0,05 mm. c) Detalle del
3
apéndice ventricular (AV) y del ciego Intestinal (CI) de la L. Barra= 0,10 mm. d) Detalle del extremo caudal de la L. Barra= 0,05
33
mm
Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dic
Invasive potential of L juveniles of
Contracaecum ogmorhini
3
art. 1=10-24
art. 2=26-41
Art 3 =42-51
art. 4=52-59
art. 5=60-65
art 6=66-79
art. 7=80-91
art 8 =92-100
art 9=102-111
nota 1=112-116
nota 2=118-123
rev =124-134
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112
con otras formas parásitas en la cavidad celómica
del hospedador en los mesenterios (Fig. 1a).
Poseen una cutícula estriada transversalmente, con
diminutas crestas longitudinales que recorren el
cuerpo hasta la cola (Figs. 1b y 2). La longitud
promedio de las larvas fue de 3,53 (2,72-4,65), con
un ancho máximo de 0,130 (0,080-0,200). La boca
está rodeada por tres primordios labiales y es
notorio un diente larval, entre la posición de los
futuros labios ventrolaterales y por delante del poro
excretor. Poro excretor anterior e interlabial se
ubica con respecto al extremo anterior a una
distancia promedio de 0,015 (0,01-0,017). Ánfidos
e interlabios no visibles. El anillo nervioso se
encuentra a 0,185 (0,150-0,250) del extremo
anterior. El esófago mide 0,44 (0,26-0,66) (Fig.
1c). El apéndice ventricular de 0,39 (0,3-0,66) de
longitud promedio, se proyecta hacia la parte
posterior desde el esófago. Ciego intestinal de
0,233 (0,15-0,39). Cola estriada, cónica y mide
0,10 (0,08-0,19). Fásmidos no visibles. No posee
mucrón terminal (Fig. 1d).
Histología larval: Se observó en la superficie
externa la cutícula, una capa homogénea de
tonalidad rosada refringente que presenta una
ornamentación externa dispuesta en pequeñas
crestas longitudinales (Fig. 2). El espesor cuticular
es de un promedio de 5,36 (3-6,73) µm. La relación
de proporción con respecto al diámetro corporal en
determinados niveles indica que no sigue un patrón
de grosor uniforme, ocurriendo zonas con la
cutícula adelgazada, en general la proporción
ronda 1:15 y 1:16. No presenta alas laterales. Los
cordones hipodérmicos corren longitudinalmente y
dividen la musculatura somática en cuatro
cuadrantes, siendo el dorsal y ventral de menor
desarrollo que los laterales. Cada cuadrante está
constituido por aproximadamente 14 células
musculares (contadas a nivel del núcleo de la
glándula excretora). El sistema excretor está
formado por una glándula unicelular gigante en
forma de cinta que corre longitudinalmente
adherida al lóbulo ventral del cordón lateral
izquierdo.
Identificación molecular de las larvas de
Contracaecum
obtenidas en
C. guatucupa
Las secuencias del gen mitocondrial de ADN COX
2 de larvas de
Contracaecum
sp. halladas en la
pescadilla de red fueron comparadas con las
siguientes secuencias disponibles del género
Contracaecum
depositadas en GenBank:
EU477207.1
Contracaecum
cf.
osculatum
D,
EU477205.1
C.
cf.
osculatum
E, EU477204.1
C
.
cf.
osculatum
B, EU477203.1
Contracaecum
cf.
osculatum
A, EU477208.1
C. osculatum
baicalensis
, EU477210.1,
C. radiatum
,