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Este artículo es publicado por la revista Neotropical Helminthology de la Facultad de Ciencias Naturales y Matemática, Universidad Nacional
Federico Villarreal, Lima, Perú auspiciado por la Asociación Peruana de Helmintología e Invertebrados Afines (APHIA). Este es un artículo de
acceso abierto, distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Atribución 4.0 Internacional (CC BY 4.0) [https://
creativecommons.org/licenses/by/4.0/deed.es] que permite el uso, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original
sea debidamente citada de su fuente original.
ISSN Versión impresa 2218-6425
ISSN Versión Electrónica 1995-1043
Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dic:107-122.
ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL
1
Laboratorio de Parasitología y Patología de Organismos Acuáticos, Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia,
Argentina.
2
Instituto de Investigaciones Biológicas y Biomédicas del Sur, INBIOSUR/UNS-CONICET, Bahía Blanca, Argentina.
3
Depto. de Genética y Biología Molecular, IACA Laboratorios, Bahía Blanca. Argentina.
*Corresponding author: rtanzola@uns.edu.ar
Noelia Adelina Galeano: https://orcid.org/0000-0002-5496-4396
Silvia Elizabeth Guagliardo: http://orcid.org/0000-0002-9565-8344
Estefanía Tittarelli: https://orcid.org/0000-0002-6882-6621
Edgardo Streitenberger: https://orcid.org/0000-0001-6453-9257
Ruben Daniel Tanzola: https://orcid.org/0000-0003-4154-3063
11,233
Noelia Adelina Galeano; Silvia Elizabeth Guagliardo; Estefanía Tittarelli; Edgardo Streitenberger & Ruben
1,2*
Daniel Tanzola
ABSTRACT
Bibliography indicates that the larvae of the genus
Contracaecum
are of zoonotic importance. These papers are
based on a single clinical case whose conclusions are doubtful and should be confirmed. In the present work,
the results of experimental infections in Balb/cAnN mice, with L juvenile of the
Contracaecum ogmorhini
3
Johnston & Mawson, 1941 complex, are reported. The helminths were obtained in the stripped weakfish,
Cynoscion guatucupa
(Cuvier, 1830), the second most important commercial fishery resource in Argentina.
The parasites were characterized by morphological and molecular criteria. Their population descriptors were
established on a sample of 112 hosts. The potential for migration to the skeletal muscle of the fishes was
evaluated and the background on experimental infection of
Contracaecum
spp. in mammalian hosts is
discussed. It is concluded that the third-stage juveniles (L) of the
C. ogmorhini
complex, can cause injury in
3
humans only if well defined conditions are met, including that the L migrate naturally to the host's musculature
3
(unproven event), that remain viable after gastric digestion by the host and that finds immunological conditions
that allow its survival in the digestive tract of the mammal host.
Neotropical Helminthology
107
DOI: http://dx.doi.org/10.24039/rnh20221621481
EVALUATION OF THE INVASIVE POTENTIAL OF L JUVENILES OF THE
CONTRACAECUM
3
OGMORHINI
JOHNSTON & MAWSON, 1941 COMPLEX (NEMATODA; ANISAKIDAE) IN AN
EXPERIMENTAL MURINE MODEL
EVALUACIÓN DE LA POTENCIALIDAD INVASORA DE JUVENILES L DEL COMPLEJO
3
CONTRACAECUM OGMORHINI
JOHNSTON & MAWSON, 1941 (NEMATODA; ANISAKIDAE) EN
UN MODELO MURINO EXPERIMENTAL
D
D
D
D
D
Keywords
: Anisakidosis – Balb/cAnN –
Contracaecum
– pathogenicity
–
experimental model
art. 1=10-24
art. 2=26-41
Art 3 =42-51
art. 4=52-59
art. 5=60-65
art 6=66-79
art. 7=80-91
art 8 =92-100
art 9=102-111
nota 1=112-116
nota 2=118-123
rev =124-134
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Los antecedentes de la literatura señalan que las larvas del género
Contracaecum
revisten importancia
zoonótica. Dichos trabajos están basados en un único caso clínico cuyas conclusiones son dudosas y
deberían confirmarse. En el presente trabajo se comunican los resultados de ensayos experimentales en
ratones Balb/cAnN, infestados con juveniles de tercer estadio (L) del complejo
Contracaecum ogmorhini
3
Johnston & Mawson, 1941, obtenidas en la pescadilla de red,
Cynoscion guatucupa
(Cuvier, 1830),
segundo recurso pesquero en importancia comercial de Argentina. Los parásitos se caracterizaron por
criterios morfológicos y moleculares. Se establecieron sus descriptores poblaciones sobre una muestra de
112 hospedadores. Se evaluó el potencial de migración al músculo esquelético de la pescadilla. Se
discuten los antecedentes sobre infestación experimental de
Contracaecum
spp. en hospedadores
mamíferos. Se concluye que los juveniles de tercer estadio (L) del complejo
C. ogmorhini
parásitos de la
3
pescadilla de red pueden provocar lesión en el humano solo si se cumplen condiciones muy definidas,
entre ellas que las L migren de modo natural a la musculatura del hospedador (evento no comprobado),
3
que permanezcan viables tras la digestión estomacal del hospedador, que encuentre condiciones
inmunológicas que permitan su sobrevida en el tubo digestivo del mamífero hospedador.
108
Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dic
RESUMEN
Palabras clave
: Anisakidosis – Balb/cAnN –
Contracaecum
– Modelo experimental – Patogenicidad
Galeano
et al.
INTRODUCCIÓN
Los productos de la pesca a nivel mundial, ocupan
un lugar primordial en la alimentación humana
como aporte de proteína (Sakanari
et al
., 1995). Sin
embargo, las malas prácticas de higiene de los
alimentos suponen un riesgo en salud pública. La
presencia de parásitos en el pescado es un
fenómeno generalizado e imposible de eliminar de
las poblaciones silvestres, porque los factores
ecológicos que determinan las infecciones
parasitarias, escapan del control humano. Entre las
enfermedades zoonóticas transmitidas por
alimentos se destaca la anisakidosis, debida al
consumo de peces y cefalópodos crudos (Ishikura
et al
., 1993). Los agentes etiológicos son
nematodes de la familia Anisakidae, entre los que
la literatura mundial reconoce principalmente
larvas pertenecientes a los géneros
Anisakis
Dujardin, 1845;
Pseudoterranova
Mozgovoi,
1951, y en menor grado
Contracaecum
Raillet &
Henry, 1912 e
Hysterothylacium
Ward & Magath,
1916
(Oshima, 1972; Jackson, 1975; Norris &
Overstreet, 1976; Oshima, 1987; Yagi
et al
., 1996;
Audicana
et al
., 2002; Audicana & Kennedy, 2008;
Degese
et al
., 2019; Morozinska-Gogol, 2019).
La mayoría de las citas sobre anisakidosis por
Contracaecum
spp. están basadas en un caso
humano por larvas de
Contracaecum
osculatum
Rudolphi, 1802 en el mar Báltico (Schaum &
Müller, 1967). Este antecedente ha sido referido en
numerosas publicaciones posteriores (Myers,
1975; Acha & Szyfres, 1977; Cheng, 1978;
Sakanari & McKerrow, 1989, Angot & Brasseur,
1993; Myjak
et al
., 1994; Field-Cortazares &
Calderón-Campos, 2009). Sin embargo, de la
lectura de Schaum & Müller (
op. cit
.), así como por
el grado de deterioro del espécimen en sus cortes
histológicos, no es posible confirmar que se trate de
larvas de
Contracaecum
ni mucho menos de la
especie
C. osculatum
. De hecho, podría tratarse
también de larvas de
Anisakis
sp. o de
Pseudoterranova
sp.
(Petter, 1969; Shiraki, 1974).
Angot & Brasseur (1995) opinan que dado que las
larvas de
Contracaecum
spp. en peces, parasitan
los mesenterios y cavidad visceral, y su
localización muscular es accidental, “su
patogenicidad, en humanos, queda por ser
demostrada”. Sumado a esto, durante mucho
tiempo, los trabajos de migración larvaria en
mamíferos destacaron los ensayos experimentales
de Cheng (1976) con larvas de
Contracaecum
spp.
No obstante, la descripción morfológica y la
presencia de L y adultos en el mismo hospedador
4
(
Gadus callarias
Linnaeus, 1758), indican que
claramente pertenecerían al género
Hysterothylacium.
Lo cierto es que, hasta el
presente, los eventos que imputan al género
Contracaecum
como agente causal de anisakidosis
son escasos e imprecisos (Menghi
et al
., 2011;
art. 1=10-24
art. 2=26-41
Art 3 =42-51
art. 4=52-59
art. 5=60-65
art 6=66-79
art. 7=80-91
art 8 =92-100
art 9=102-111
nota 1=112-116
nota 2=118-123
rev =124-134
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109
Shamsi & Butcher, 2011). Kliks (1983), con el
término “anisakiasis transitoria”, designó una
forma benigna, con expulsión por vía oral de larvas
de
Pseudoterranova
sp. y de
Anisakis
sp. Tal podría
ser el caso de los citados reportes de
Contracaecum
sp. en humanos. Procurando esclarecer su
potencial invasor, en el presente trabajo se
comunican los resultados de ensayos
experimentales en ratones, infestados con larvas L
3
del complejo
Contracaecum ogmorhini
, Johnston
& Mawson, 1941 obtenidas en la pescadilla de red,
Cynoscion guatucupa
(Cuvier, 1830)
(Perciformes: Sciaenidae). Ruarte
et al
. (2004)
señalan que la pescadilla de red es el segundo
recurso en importancia comercial de Argentina, por
tal motivo se ha elegido este hospedador.
Toma y análisis de muestras
Fueron procesados 112 ejemplares adultos de
C.
guatucupa
capturados entre 2009 y 2011 por la
flota pesquera comercial que opera en el estuario de
Bahía Blanca (38º44' S y 61º45' O), Argentina. Se
evisceraron completamente antes de transcurridas
ocho h post-captura. Se registraron la talla y el peso
(total y eviscerado) en cm y g, respectivamente. Se
examinaron macroscópicamente la superficie
cutánea, branquial y oral; las vísceras dispuestas en
la cavidad celómica y mesenterios.Los nematodos
recolectados se fijaron y conservaron en etanol 70º,
para estudios morfológicos, y etanol 96°, para
estudios moleculares. Se calcularon los
indicadores parasitarios prevalencia (P),
intensidad media (IM) y abundancia media (AM),
según Bush
et al.
(1997). Los valores de
abundancia e intensidad se indican como el
promedio y, entre paréntesis, el rango o amplitud y
el error estándar de la media. Las medidas de los
caracteres morfológicos están expresadas en
milímetros (mm) como el promedio y el rango
entre paréntesis, salvo que se indique otra unidad.
Se hallan depositados 12 especímenes L voucher,
3
conservados en alcohol etílico al 70%, en la
colección de Helmintos de la División Zoología
Invertebrados del Museo de La Plata bajo el
número MLp- He 7769.
Identificación molecular
La obtención de ADN se realizó a partir de
digestión enzimática de las larvas. Se colocaron las
larvas en 200µL de solución fisiológica, se agregó
igual volumen de MagnaPure DNA Tissue Lysis
buffer (Roche®) y 20µL de proteinasa K. La
mezcla fue incubada durante 30 minutos a 56ºC.
Para inactivar la proteinasa K, la muestra fue
sometida a 95ºC por 10 min. Luego, el ADN se
purificó utilizando un sistema automatizado
MagnaPure Compact (Roche®), con un volumen
final de elución de 50µL. Mediante el empleo de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se
amplificaron 4 segmentos del genoma: un
fragmento de 519 pb correspondiente al gen de la
citocromo oxidasa 2 mitocondrial (COX-2). Se
emplearon los siguientes primers: El gen COX 2
fue amplificado con los primers 211F 5´-TTT TCT
AGT TAT ATA GAT TGR TTY AT-3´ y 210 R 5´-
CAC CAA CTC TTA AAA TTA TC-3´ de acuerdo
a los procedimientos descriptos por Garbin
et al
.
(2011). La amplificación se llevó a cabo usando el
Kit HotStarTaq PlusMaster Mix (QIAGEN®), con
una concentración final de la master mix de 1 X,
0,5-5 ng de ADN y 0,5 µM de cada uno de los
primers, en un volumen final de 25 µL. La PCR se
realizó en un termociclador Veriti (Applied
Biosystems®) usando los siguientes parámetros de
ciclado: 95◦C 10 min, 34 ciclos de 95◦C 30 s, 46◦C
60s y 72◦C 90s, y una extensión final de 72◦C por
10 min. Los productos de PCR se corrieron en un
gel de agarosa al 2% para verificar la efectividad de
la amplificación. Las bandas se visualizaron por
tinción con bromuro de etidio utilizando luz UV.
Finalmente, los productos fueron purificados con
el kit de purificación PCR QIAquick (Qiagen®) y
cuantificados con un espectrofotómetro NanoDrop
1000 (Thermo Scientific®). El producto de PCR
purificado se secuenció en ambos sentidos usando
el kit BigDye Terminator v.1.1 de Applied
Biosystem® en un volumen final de 20 µL, con una
dilución de la master mix de 0,125X, 1µM de cada
primer y 15 ng de producto de PCR. Los
parámetros de ciclado fueron: 96◦C 1 min, 30
ciclos de 96◦C 10 s, 50◦C 5 s y 60◦C 4 min. Los
productos de secuenciación se corrieron en un
secuenciador automático ABI 3500 de Applied
Biosystem® y se analizaron mediante el programa
Sequencing Analysis v5,4.
Para analizar las relaciones filogenéticas, se
buscaron secuencias del gen COX-2 depositadas
MATERIALES Y MÉTODOS
Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dic
Invasive potential of L juveniles of
Contracaecum ogmorhini
3
art. 1=10-24
art. 2=26-41
Art 3 =42-51
art. 4=52-59
art. 5=60-65
art 6=66-79
art. 7=80-91
art 8 =92-100
art 9=102-111
nota 1=112-116
nota 2=118-123
rev =124-134
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110
en la base de datos GenBank (NCBI). Se realizaron
dos alineamientos distintos, uno general (44
secuencias) con el objetivo de visualizar la
asociación entre la secuencia de la especie en
estudio y las secuencias encontradas en GenBank.
En un segundo alineamiento, más reducido (11
secuencias), se estudiaron asociaciones entre la
secuencia en estudio y aquellas correspondientes a
hospedadores mamíferos. Posteriormente, se
alinearon las secuencias mediante el programa
Muscle. Se utilizó el programa Jmodel Test para
evaluar el modelo evolutivo que mejor aplicaba a
nuestro alineamiento (Darriba
et al.
, 2012). Se
realizaron los análisis filogenéticos aplicando
distintos métodos: distancia o Neighbor-Joining
(NJ) (Saitou & Nei, 1987), Máxima parsimonia
(MP) a través del programa MEGA v.5.2 (Tamura
et al
., 2011) y bayesianos (MrBayes software
v.3.2.6 ([Ronquist & Huelsenbeck, 2003]). El
soporte de las ramas para el método de NJ y MP, se
evaluó mediante 1.000 repeticiones de boostrap,
considerando una rama confiable aquella con un
valor mayor al 70 %. Para MP se realizó consenso
estricto (el 100% de los árboles más parsimoniosos
encontrados presentan esa topología de ramas) y
consenso mayoría (lo mismo, pero en el 50% o más
de los árboles). En la metodología bayesiana donde
se implementó la cadena de Markov de Monte
Carlo (MCMC), la convergencia de la misma se
evaluó considerando un desvío estándar en las
frecuencias de los clados menor a 0,01 y valores de
población efectiva (ESS) mayor a 200. Valores que
se verificaron utilizando el programa Tracer v.1.5.
Los resultados de las estimaciones de árboles se
resumieron descartando el 10% de los árboles que
se guardaron. El soporte de las ramas, en este
método, fue evaluado mediante probabilidad
a
posteriori
, considerando una rama confiable
aquella con un valor mayor a 0,7. La visualización
de los árboles obtenidos se realizó mediante el
software FigTree v.1.4.2.
La secuencia de consenso obtenida (556 bp) fue
depositada en GenBank bajo el número de acceso
On854976.
Digestión enzimática del músculo estriado de
C.
guatucupa
Con el fin de comprobar la migración de las larvas
desde la cavidad corporal hacia el músculo se
tomaron muestras de musculatura ventral, dorsal y
lateral de los peces en cuestión. Se procedió a su
digestión enzimática artificial. La solución
digestora consistió en: solución salina de ácido
clorhídrico (pH=1-2) con 10 g de Pepsina (riqueza
1:10.000) por L de solución salina. En un vaso de
precipitado se introdujo la muestra de filete y la
solución para digestión, en una proporción 1:2,
respectivamente. Se incubó en baño termostático a
una temperatura de 37º C por un período de cinco
horas, se agitó con varilla de vidrio. El líquido
resultante se observó bajo lupa estereoscópica.
Infestación en modelo murino
Se recolectaron larvas de
Contracaecum
sp. de la
cavidad corporal de los peces. Se utilizaron para la
infestación dos cepas de ratones, Balb/cAnN y CF1
de dos meses de vida y con un peso de
aproximadamente 25 g. Los animales fueron
mantenidos en el Bioterio del Depto. de Biología,
Bioquímica y Farmacia bajo condiciones de
temperatura controlada, entre 20 – 25ºC, con
periodos de 12 horas luz/12 horas oscuridad. Las
larvas fueron introducidas en el estómago de los
ratones con una cánula de 15G que se encontraba
sujeta a una jeringa de 5 mL y/o con pipeta plástica.
Realizada la inoculación de las larvas se observó la
materia fecal de los ratones durante las 24 h post-
inoculación (PI).
Transcurrido el tiempo de infestación los ratones
fueron sacrificados humanamente siguiendo los
protocolos para la protección de los animales
usados para la experimentación (UE 2010). Se
disecó y observó bajo lupa estereoscópica el tubo
digestivo de cada animal en toda su extensión para
localizar la posible inserción de larvas. Como
técnicas histológicas de rutina, los órganos fueron
fijados en formalina 10% y en glutaraldehído 2,5%
(en frío, para ser estudiados con microscopio
electrónico de barrido) (Marca EVO 40
perteneciente al CCT/CONICET Bahía Blanca). El
material fijado en glutaraldehído 2,5%, fue lavado
en buffer y se procedió a la deshidratación en
acetonas de 35º, 50º, 70º, 80º, 100º. Se realizó
secado por punto crítico (Marca Polaroid) y
posteriormente se metalizó con oro (Sputter coater,
Pelco® 91000, 300 Å).
Para el análisis histopatológico se realizaron cortes
a 5 µm teñidos con hematoxilina y eosina y
tricrómico de Masson.
Aspectos éticos
: Los autores señalan que se
Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dic
Galeano
et al.
art. 1=10-24
art. 2=26-41
Art 3 =42-51
art. 4=52-59
art. 5=60-65
art 6=66-79
art. 7=80-91
art 8 =92-100
art 9=102-111
nota 1=112-116
nota 2=118-123
rev =124-134
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111
cumplieron las normativas éticas nacionales e
internacionales.
Identificación morfológica y molecular del
parásito
Se examinaron 112 ejemplares (33 hembras, 60
machos y 19 individuos de sexo indeterminado) de
C. guatucupa,
cuyas talla y peso totales fueron
45,31 (25,7-53,2) cm y 792,94 (415-1.496) g,
respectivamente. En ellos se encontró un total de
499 larvas identificadas morfológicamente
a priori
como
Contracaecum
sp. El 84,6% estaba asociado
a los mesenterios y 15,4% libres en la cavidad
celómica, con una prevalencia de 57,1%,
abundancia media de 4,44 (0-9; 2,63) e intensidad
promedio de 7,78 (1-12; 3,15).
Descripción del parásito (n= 20)
Contracaecum
sp. L
3
Los ejemplares fueron hallados libres o asociados
RESULTADOS
Figura 1.
a)
Contracaecum
L del complejo
C. ogmorhini
(
in toto
) de la cavidad visceral de
C.
guatucupa
. Barra= 0,2 mm. b)
3
Extremo anterior de la L señalando el diente perforante (D) y ubicación del poro excretor (*). Barra= 0,05 mm. c) Detalle del
3
apéndice ventricular (AV) y del ciego Intestinal (CI) de la L. Barra= 0,10 mm. d) Detalle del extremo caudal de la L. Barra= 0,05
33
mm
Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dic
Invasive potential of L juveniles of
Contracaecum ogmorhini
3
art. 1=10-24
art. 2=26-41
Art 3 =42-51
art. 4=52-59
art. 5=60-65
art 6=66-79
art. 7=80-91
art 8 =92-100
art 9=102-111
nota 1=112-116
nota 2=118-123
rev =124-134
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112
con otras formas parásitas en la cavidad celómica
del hospedador en los mesenterios (Fig. 1a).
Poseen una cutícula estriada transversalmente, con
diminutas crestas longitudinales que recorren el
cuerpo hasta la cola (Figs. 1b y 2). La longitud
promedio de las larvas fue de 3,53 (2,72-4,65), con
un ancho máximo de 0,130 (0,080-0,200). La boca
está rodeada por tres primordios labiales y es
notorio un diente larval, entre la posición de los
futuros labios ventrolaterales y por delante del poro
excretor. Poro excretor anterior e interlabial se
ubica con respecto al extremo anterior a una
distancia promedio de 0,015 (0,01-0,017). Ánfidos
e interlabios no visibles. El anillo nervioso se
encuentra a 0,185 (0,150-0,250) del extremo
anterior. El esófago mide 0,44 (0,26-0,66) (Fig.
1c). El apéndice ventricular de 0,39 (0,3-0,66) de
longitud promedio, se proyecta hacia la parte
posterior desde el esófago. Ciego intestinal de
0,233 (0,15-0,39). Cola estriada, cónica y mide
0,10 (0,08-0,19). Fásmidos no visibles. No posee
mucrón terminal (Fig. 1d).
Histología larval: Se observó en la superficie
externa la cutícula, una capa homogénea de
tonalidad rosada refringente que presenta una
ornamentación externa dispuesta en pequeñas
crestas longitudinales (Fig. 2). El espesor cuticular
es de un promedio de 5,36 (3-6,73) µm. La relación
de proporción con respecto al diámetro corporal en
determinados niveles indica que no sigue un patrón
de grosor uniforme, ocurriendo zonas con la
cutícula adelgazada, en general la proporción
ronda 1:15 y 1:16. No presenta alas laterales. Los
cordones hipodérmicos corren longitudinalmente y
dividen la musculatura somática en cuatro
cuadrantes, siendo el dorsal y ventral de menor
desarrollo que los laterales. Cada cuadrante está
constituido por aproximadamente 14 células
musculares (contadas a nivel del núcleo de la
glándula excretora). El sistema excretor está
formado por una glándula unicelular gigante en
forma de cinta que corre longitudinalmente
adherida al lóbulo ventral del cordón lateral
izquierdo.
Identificación molecular de las larvas de
Contracaecum
obtenidas en
C. guatucupa
Las secuencias del gen mitocondrial de ADN COX
2 de larvas de
Contracaecum
sp. halladas en la
pescadilla de red fueron comparadas con las
siguientes secuencias disponibles del género
Contracaecum
depositadas en GenBank:
EU477207.1
Contracaecum
cf.
osculatum
D,
EU477205.1
C.
cf.
osculatum
E, EU477204.1
C
.
cf.
osculatum
B, EU477203.1
Contracaecum
cf.
osculatum
A, EU477208.1
C. osculatum
baicalensis
, EU477210.1,
C. radiatum
,
Figura 2.
Corte transversal de la larva L mostrando el detalle de estrías longitudinales (flechas), cordones hipodérmicos laterales
3
(CH) y la glándula excretora (GE) con su ducto colector (DC). Hematoxilina y eosina. Barra: = 0,02 mm.
Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dic
Galeano
et al.
art. 1=10-24
art. 2=26-41
Art 3 =42-51
art. 4=52-59
art. 5=60-65
art 6=66-79
art. 7=80-91
art 8 =92-100
art 9=102-111
nota 1=112-116
nota 2=118-123
rev =124-134
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113
EU477213.1,
C. mirounga
Nikolskii, 1974,
EU852337.1,
C. gibsoni
Mattiucci, Paoletti,
Solorzano & Nascetti, 2010 (
Contracaecum
aff.
multipapillatum
A), EU852343.1,
C. overstreeti
Mattiucci, Paoletti, Solorzano & Nascetti, 2010
(
Contracaecum
aff.
multipapillatum
B),
JN580992.1
C. pelagicum
(Johnston & Mawson,
1942) (larvas), JN580993.1,
C. pelagicum
(larvas),
EF535569.1, EF535568.1, EF122210.1,
C.
pelagicum
, EU852350.1,
C. micropapillatum
(Stossich, 1890) Baylis, 1920, EF513494.1,
C.
bioccai
Mattiucci, Paoletti, Olivero-Verbel,
Baldiris, Arroyo-Salgado, Garbin, Navone,
Nascetti, 2008, HQ328504.1,
C. chubutensis
Garbin, Diaz, Cremonte & Navone, 2008,
EF513512.1,
C. septentrionale
Kreis, 1955,
GQ847541.1, GQ847544.1, GQ847532.1,
GQ847542.1, GQ847536.1, GQ847533.1,
GQ847539.1, GQ847543.1, GQ847538.1,
GQ847534.1,
Contracaecum
sp., GQ847537.1
Contracaecum
57 sp. (
C. australe
) EF558892.1,
EF513501.1, EF122202.1, EF535570.1,
EF558891.1, EF122203.1, EF122204.1,
EF513506.1, EF513511.1, EF558896.1,
C.
rudolphii
Hartwich, 1964, EU477211.1,
C.
ogmorhini
Johnston & Mawson, 1941,
EU477212.1,
C. margolisi
Mattiuci, Cianchi,
Paggi, Sardella, Timi, Webb, Bastida, Rodriguez &
Bullini, 2003, DQ116435.1, y
Pseudoterranova
ceticola
(Deardorff & Overstreet, 1981) Gibson,
1983. Debido a la asociación de la especie
estudiada con otras que parasitan mamíferos
marinos, se decidió ensayar un nuevo alineamiento
solo con estas especies. La Fig. 3 muestra, a manera
de síntesis, el árbol de consenso inferido por
análisis Bayesiano, en el que se destaca claramente
la proximidad filogenética de las larvas estudiadas
en el presente trabajo, que agrupan con ambos
miembros del complejo
C. ogmorhini
. Los
métodos alternativos utilizados, NJ y MP, arrojaron
resultados coincidentes. Por tal motivo, se
identifican las larvas utilizadas para los ensayos
experimentales como miembros de dicho complejo
de especies crípticas.
Digestión enzimática. Presencia de larvas en
filetes de
C. guatucupa
Cynoscion guatucupa
, constituye uno de los
principales recursos pesqueros costeros de
Argentina con un alto consumo en el mercado
interno.
Contracaecum
es un género con
representantes que al estado adulto parasitan
mamíferos pinnípedos, que forman grandes
asentamientos en las costas marítimas. En estos
hospedadores suelen alcanzar altos valores de
prevalencia y abundancia, del mismo modo que en
peces costeros, como la pescadilla de red, sobre los
cuales depredan. Se extrajo por cada pez un
promedio de 58,27 g de filete, principalmente de
los flancos, que, de acuerdo a la bibliografía, es la
región donde con mayor probabilidad se alojan
larvas de anisákidos. Se digirió un total de 3.479,25
g de musculatura esquelética. No fue hallada
ninguna larva de nematode en ninguno de los
digestores, lo que permite inferir que las larvas
encontradas en alta prevalencia y abundancia en la
cavidad visceral, no migran a la musculatura de la
pescadilla.
Invasión tisular de larvas del complejo
Contracaecum ogmorhini
en un hospedador
mamífero experimental
Se inocularon por vía oral cuatro ratones cepa CF1
con larvas provenientes de la pescadilla. En el
primero se inocularon 12 larvas. En un segundo
ratón se inocularon cinco larvas
.
En el tercer ratón
se inocularon 10 larvas y en un cuarto ratón, 12. La
necropsia de los ratones se realizó a los 3, 10, 14 y
24 días PI. En ninguno de los casos se observaron
larvas fijadas en el tubo digestivo o cicatrices
provocadas por las mismas. Posteriormente se
inocularon dos ratones de cepa Balb/cAnN. A uno
de ellos se le administraron 23 larvas y a un
segundo ratón, 18. Al observar la materia fecal de
los ratones 24 hs PI se pudo observar en uno de
ellos, la presencia de una larva muerta
perteneciente a
Contracaecum
sp. La necropsia de
los ratones se realizó a los seis y nueve días,
respectivamente, posteriores a la inoculación. No
se observaron larvas en el tubo digestivo.
Nuevamente se inocularon dos ratones de cepa
Balb/cAnN con 20 larvas a cada uno. La necropsia
se realizó a los 5 y 12 días PI. En ninguno de los
casos se observaron larvas fijadas en el tubo
digestivo o cicatrices provocadas por las mismas.
Algunos días después se volvieron a inocular dos
ratones de cepa Balb/cAnN y uno CF1 con 20
larvas de
Contracaecum
sp. Este último no dio
resultado positivo a la infección. A uno de los
ratones Balb/cAnN se le inocularon 50 larvas de
Contracaecum
sp. La necropsia fue realizada 24 h
PI. Al analizar el tubo digestivo se observó una
larva fijada en el estómago (Fig. 4). La
histopatología evidenció a la larva penetrando el
Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dic
Invasive potential of L juveniles of
Contracaecum ogmorhini
3
art. 1=10-24
art. 2=26-41
Art 3 =42-51
art. 4=52-59
art. 5=60-65
art 6=66-79
art. 7=80-91
art 8 =92-100
art 9=102-111
nota 1=112-116
nota 2=118-123
rev =124-134
image/svg+xml
114
Figura 3.
Árbol de consenso inferido por análisis Bayesiano (B), deducido del análisis de las secuencias COX2 ADNmt de
Contracaecum
spp. conocidas hasta el presente en 1.000.000 de generaciones. Los números en los nodos son las probabilidades
(%)
a posteriori
(Pp) por el análisis bayesiano con un apoyo importante de Pp ≥ 95%.
Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dic
Galeano
et al.
art. 1=10-24
art. 2=26-41
Art 3 =42-51
art. 4=52-59
art. 5=60-65
art 6=66-79
art. 7=80-91
art 8 =92-100
art 9=102-111
nota 1=112-116
nota 2=118-123
rev =124-134
image/svg+xml
115
epitelio de la mucosa, en la región fúndica
estomacal, hasta alcanzar la capa muscular (Fig. 5).
Se observó una compresión total del epitelio, con
pérdida de la estructura glandular y adoptando un
aspecto aplanado en torno a la larva. Un infiltrado
leucocitario con presencia de macrófagos,
neutrófilos, eosinófilos y linfocitos, rodeaba los
tejidos próximos al sitio de penetración. Un
segundo ratón cepa Balb/cAnN inoculado con 45
larvas, en la necropsia realizada 24 h PI, presentó
dos larvas vivas fijadas a la pared de la cavidad
gástrica (Figs. 6 y 7). En resumen, de un total de
ocho ratones Balb/cAnN infestados
experimentalmente, en dos hubo resultados
positivos confirmando la penetración de larvas de
Contracaecum
del complejo
C. ogmorhini
en la
mucosa gástrica.
Figura 4.
Larva L de
Contracaecum
del complejo
C. ogmorhini
prendida en la mucosa gástrica de ratón Balb/cAnN.
3
Figura 5.
Sección histológica del estómago de ratón Balb/cAnN mostrando el sitio de inserción de una L, la lesión ulcerativa que
3
provoca, así como la intensa infiltración inflamatoria en la mucosa y submucosa. Barra= 0,2 mm.
Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dic
Invasive potential of L juveniles of
Contracaecum ogmorhini
3
art. 1=10-24
art. 2=26-41
Art 3 =42-51
art. 4=52-59
art. 5=60-65
art 6=66-79
art. 7=80-91
art 8 =92-100
art 9=102-111
nota 1=112-116
nota 2=118-123
rev =124-134
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116
Figura 6
. Larva L de
Contracaecum
en el sitio de penetración de la pared estomacal de ratón Balb/cAnN. SEM.
3
Figura 7
. Dos L
de
Contracaecum
penetrando la pared gástrica de ratón Balb/cAnN. SEM.
3
Schaum & Müller (1967) comunicaron un caso
humano de heteroqueilidiasis (antiguo nombre
usado para la anisakidosis) en un joven alemán de
26 años, con antecedentes de consumir
habitualmente pescado semicrudo en el mar
Báltico. El paciente presentaba fuertes dolores
abdominales en la región del apéndice cecal. Por
laparotomía le fue extraído el apéndice, y las
imágenes histológicas del absceso que había
desarrollado, revelaron la presencia de una larva de
nematodo ascaroideo. Los autores la identificaron
con certeza como
C. osculatum
sobre la base de
encontrar similitud en la porción anterior del
parásito, asociado a que tal especie de anisákido es
muy frecuente en peces costeros del Báltico.
Realizaron múltiples estudios inmunológicos en el
paciente, y ninguno arrojó resultados concluyentes
sobre la identidad del nematodo. A pesar de ello, los
autores insistieron en confirmar que se trataba de
DISCUSIÓN
Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dic
Galeano
et al.
art. 1=10-24
art. 2=26-41
Art 3 =42-51
art. 4=52-59
art. 5=60-65
art 6=66-79
art. 7=80-91
art 8 =92-100
art 9=102-111
nota 1=112-116
nota 2=118-123
rev =124-134
image/svg+xml
117
larvas de
C. osculatum
. Esa afirmación constituyó
el primer caso reportado de anisakidosis por una
especie de
Contracaecum,
y el único conocido a
nivel mundial hasta hace relativamente pocos años,
en que se dieron a conocer dos casos adicionales
(Smith, 1999; Menghi
et al
., 2011; Shamsi &
Butcher, 2011)
.
Actualmente se acepta que no hay
ningún rasgo morfológico que permita establecer
la identidad específica en los estadios larvales de
los nematodes anisákidos. Oshima (1972) descartó
que la infección humana por
C. osculatum
pudiera
ocurrir en la región de Extremo Oriente. Shiraki
(1974) puso en dudas el hallazgo de Schaum &
Müller (
op.cit
.) debido al mal estado del ejemplar
en las secciones de tejido, cuya cutícula se ve
deformada y el tubo digestivo degenerado, al punto
de plantear que no hay suficientes razones como
para descartar que el parásito pudiera ser
Anisakis
o
Terranova
(
sic
) en lugar de
C. osculatum
. Autores
posteriores continuaron citando el antecedente de
Schaum & Müller (
op.cit
.), y conservaron en la
lista de especies de anisákidos de interés sanitario a
C. osculatum
(Myers, 1975; Acha & Szyfres, 1977;
Cheng, 1978; Angot & Brasseur, 1993; Myjak
et
al
., 1994; Tanzola, 2006; Tanzola & Guagliardo,
2008).
Contracaecum osculatum
primariamente
infecta el hígado, las vísceras y la cavidad visceral,
siendo una de las especies dominantes durante todo
el año en el bacalao del Atlántico,
Gadus morhua
Linnaeus, 1758 (Severin
et al
., 2020). La presencia
de larvas de
Contracaecum
sp. en la musculatura
esquelética de los peces se considera accidental
(Angot & Brasseur, 1995). Los resultados de la
digestión enzimática de filetes de
C. guatucupa
en
el presente trabajo, equivalente a 60 ejemplares
elegidos aleatoriamente durante todo el período de
estudio (2009-2011), no arrojó ninguna evidencia
de invasión muscular de larvas de
Contracaecum
sp., a pesar de haberse recolectado casi 500
juveniles L en la cavidad visceral y la serosa
3
peritoneal de las 112 pescadillas procesadas.
Mediante el empleo de marcadores moleculares
alozímicos y ADN mitocondrial, se ha demostrado
la heterogeneidad genética de
Contracaecum
ogmorhini
Johnston & Mawson, 1941, especie
descripta en la costa sur de Australia, como parásita
de la foca leopardo,
Hydrurga leptonix
(de
Blainville, 1820). De modo tal que en el complejo
de especies gemelas
C. ogmorhini
es posible
agrupar a
C. ogmorhini
(
s.s
.), parásita del lobo
marino de dos pelos,
Arctocephalus australis
(Zimmermann, 1783) en los mares australes, y
C.
margolisi
, parásita del lobo marino de California,
Zalophus californianus
(Lesson, 1828) (Mattiucci
et al
., 2017). Los estadios larvales de ambas
especies son morfológicamente indistinguibles,
razón por la que se hace imprescindible el empleo
de herramientas moleculares. Como se adelantó,
nuestro material agrupa en este complejo con
significativo porcentaje de similitud.
Shiraki (1969) administró por vía oral a conejos,
larvas de
Anisakis
sp.,
Pseudoterranova
sp. y
Contracaecum
sp. Al cabo de 24 hs PI solo las
larvas de
Anisakis
y
Pseudoterranova
habían
logrado penetrar la pared gástrica, pero no las de
Contracaecum
. Otsuru
et al
. (1968) administraron
también a conejos larvas de
Contracaecum
sp. y de
Pseudoterranova
sp. alcanzando los mismos
resultados que Shiraki (1969). Solo las larvas de
Pseudoterranova
lograron penetrar la mucosa
estomacal a las 3 hs PI, en tanto la mayoría de las
larvas de
Contracaecum
fueron encontradas
muertas en el tracto digestivo. Empleando el
mismo modelo experimental de Shiraki (1969) y
Oishi
et al
. (1974) inocularon vía oral, larvas de
Anisakis
sp.,
Pseudoterranova
sp. y
Contracaecum
sp. procedentes de peces marinos, y observaron
que
Pseudoterranova
penetraba en forma más
potente la mucosa digestiva,
Anisakis
en tanto la
invadía de forma más débil y
Contracaecum
no
producía invasión tisular.
Utilizando perros, Shiraki (1969) administró
oralmente larvas de
Anisakis
sp.,
Pseudoterranova
sp. y
Contracaecum
sp. obtenidas en peces
marinos. Al cabo de 24 h PI solo las larvas de
Anisakis
y
Pseudoterranova
habían logrado
penetrar la pared gástrica, no así las de
Contracaecum.
Si bien en ninguno de los trabajos
citados se hace mención del estadio larval
utilizado, es probable que en todos los ensayos
hayan sido larvas de tercer estadio presentes en la
cavidad visceral de los peces.
Deardorff &Overstreet (1980a) infectaron por vía
oral con L ratas, pollitos y crías de patos sin éxito.
3
Cuando insertaron L por medio quirúrgico a ratas,
3
pollos, ratones blancos y hamsters, solo en las ratas
se lograron mantener o viables, que mudaron a fase
de adulto en 10 días y se mantuvieron vivos hasta
nueve meses PI.
Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dic
Invasive potential of L juveniles of
Contracaecum ogmorhini
3
art. 1=10-24
art. 2=26-41
Art 3 =42-51
art. 4=52-59
art. 5=60-65
art 6=66-79
art. 7=80-91
art 8 =92-100
art 9=102-111
nota 1=112-116
nota 2=118-123
rev =124-134
image/svg+xml
118
Fagerholm (1988) ensayó con L de
C. osculatum
3
obtenidas en peces inoculando por vía oral ratas y
hamsters. Entre dos y cinco días PI logró obtener el
estadio de L. En otro experimento, introdujo
4
quirúrgicamente L y a los 42 días PI desarrollaron
3
algunos adultos encapsulados, con lo que pudo
confirmar la identidad específica de las larvas
utilizadas.
Cabe destacar el ensayo experimental de Vidal-
Martínez
et al.
(1994), quienes trabajaron con
juveniles de cuarto estadio (L) de
C.
4
multipapillatum
, un anisákido que tiene como
hospedadores definitivos aves piscívoras, como
cormoranes y garzas, pero no mamíferos. Las L
4
encapsuladas, extraídas del cíclido
Cichlasoma
urophthalmus
(Günther, 1862), un recurso
pesquero consumido habitualmente por habitantes
de Yucatán, México, fueron administradas por vía
oral a un gato de 2 meses de edad, a pollos de 3
semanas de edad, ratas de 1 mes y patos de 1-2
meses. No hubo resultados positivos a la infección
en las ratas, pollos ni en los patos. Sin embargo, en
el intestino anterior del gato hallaron machos
maduros y hembras grávidas del nematode y tres
vermes adheridos a la mucosa. Estos resultados
confirmaron la potencialidad de
C.
multipapillatum
de infectar mamíferos, a pesar de
ser un anisákido con marcada especificidad por
aves piscívoras. Vidal-Martínez
et al
. (1994)
señalan que, si bien
C. multipapillatum
parasita de
manera natural la cavidad visceral, el hígado y
riñones del pez
C. urophthalmus
,
accidentalmente
podría ingresar al ser humano si en el proceso de
evisceración quedaran adheridos fortuitamente al
filete restos de peritoneo con alguna larva viable.
Ello debiera además estar asociado al consumo de
ese filete crudo o insuficientemente cocido.
Asimismo, los autores hacen la salvedad que el
hecho de haber empleado juveniles de cuarto
estadio en la infestación experimental, en lugar de
3
L como en los experimentos precedentes, podría
tener la ventaja que el desarrollo avanzado del
parásito ayude a inducir infectividad en los
mamíferos. Indudablemente la inserción
quirúrgica de larvas de anisákidos ha dado en
numerosas oportunidades resultados que reflejan la
capacidad de los parásitos de mantenerse viables,
incluso mudar al estadio adulto. Pero ésta es
claramente una situación forzada que escapa a la
consideración de su rol zoonótico potencial, en
virtud de que la puerta de entrada de los anisákidos
al ser humano es a través del consumo de carne de
pescado crudo, infectada con sus larvas. Algunos
autores, recientemente han acuñado el término
“contracecosis” para referirse a los trastornos
provocados en el humano por larvas de
C.
multipapillatum,
pese a no conocerse ningún
registro documentado de tal infección (Choc
et al
.,
2020).
En el presente estudio ocho ratones Balb/cAnN
fueron inoculados con un total de 215 larvas, todas
juveniles de tercer estadio (L) del complejo
C.
3
ogmorhini.
Del total, 99,98% fueron defecadas
muertas o destruidas en el tracto digestivo de los
ratones. Solo tres larvas sobrevivieron y lograron
penetrar en la mucosa gástrica de los hospedadores.
La cepa Balb/cAnN se conoce por ser más
susceptible a las infestaciones experimentales en
contraste con la cepa CF1, más resistente. Esto
puede explicar la diferencia en la infectividad de
los parásitos en ambos modelos estudiados.
Menghi
et al.
(2011) reportaron el hallazgo en la
materia fecal de una niña de nueve años en Buenos
Aires (Argentina) de un nematodo al que, por la
morfología labial y presencia de un mucrón caudal,
identifican como perteneciente al “complejo
Anisakis-Contracaecum
” (
sic
). Los autores aclaran
que esta determinación, fue confirmada a partir de
imágenes fotográficas por el CDC de Atlanta,
EEUU. La paciente presentaba un cuadro de
desnutrición y poliparasitismo por
Ascaris
lumbricoides
, Limaeus, 1758 varias especies de
Entamoeba
,
Endolimax nana
Wenyon &
O'Connor, 1917 y
Blastocystis hominis
(Alexieff,
1911) Brumpt, 1912. Además, la niña habitaba en
condiciones sanitarias deficientes y su principal
fuente de alimentos era pescado obtenido de la
pesca, sin precisar de qué especie de pescado se
trataba, ni si el mismo era consumido crudo o
cocido. Dado lo poco probable que la paciente
hubiese consumido pescado crudo, ya que no es el
modo de preparación común en Argentina, sumado
a la sintomatología gastroentérica compleja,
agravada por su desnutrición y poliparasitismo, y a
la imprecisa determinación del parásito como
miembro de un complejo taxonómico no validado
(los complejos específicos en los anisákidos se
establecen entre especies crípticas a través de un
perfil genético molecular, y no entre géneros
[Mattiucci & Nascetti, 2008], en el presente trabajo
se considera dudoso el hallazgo reportado por
Neotropical Helminthology, 2022, 16(2), jul-dic
Galeano
et al.
art. 1=10-24
art. 2=26-41
Art 3 =42-51
art. 4=52-59
art. 5=60-65
art 6=66-79
art. 7=80-91
art 8 =92-100
art 9=102-111
nota 1=112-116
nota 2=118-123
rev =124-134
image/svg+xml
119
Menghi
et al.
(2011). Poder precisar la identidad
taxonómica del material, permitiría enmarcar
dicho reporte en lo que se denomina anisakiasis
transitoria, que como se explicó previamente, sería
una forma banal de infección (Kliks, 1983). En
relación a cuadros de anisakiasis luminal
transitoria, Shamsi & Butcher (2011), reportaron la
expulsión por materia fecal de una larva,
compatible con
Contracaecum
sp., de una paciente
australiana con antecedentes de haber consumido
caballa cruda,
Scomber scombrus
Linnaeus, 1758,
en el sur de Australia. La mujer, mayor de edad,
manifestaba fuertes dolores abdominales, vómitos
y diarrea. Fue medicada y al tercer día de
internación hospitalaria se produjo el evento de
deposición de la larva. El espécimen fue
determinado a partir de rasgos morfológicos del
tubo digestivo anterior y la posición del poro
excretor. Por lo que se conoce, este sería un
antecedente válido de efectos nocivos de una larva
viva perteneciente al género
Contracaecum
en el
ser humano.
Finalmente, la literatura cuenta con numerosos
antecedentes de invasión gástrica de anisákidos en
sus hospedadores definitivos marinos. Obiekezie
et al.
(1992) describieron las lesiones en las
paredes del estómago del eperlano,
Osmerus
eperlanus
(Linnaeus, 1758)
.
Deardorff &
Overstreet (1980b) tipificaron las alteraciones
histopatológicas causadas por
Goezia pelagia
Deardorff & Overstreet, 1980 en el estómago de los
peces marinos
Rachycentron canadum
(Linnaeus,
1766) (bacalao),
Chaetodipterus faber
(Broussonet, 1782) (pez ángel)
y
Ophicthus
sp.
(anguila). Kinne (1984) señala lesiones nodulares
fibróticas en la pared del estómago del tiburón
martillo,
Sphyrna lewini
(Griffith & Smith, 1834),
provocadas por
Terranova brooksi
Jacobson &
Kistner, 1998
.
Tanzola (2004) describió las
lesiones ulcerativas que provoca
Terranova
galeocerdonis
(Thwaite, 1927)
en la pared gástrica
del tiburón toro o escalandrún,
Carcharias taurus
4
Rafinesque, 1810 y la localización de sus L en la
submucosa estomacal. Ito
et al
. (1998) reportaron
lesiones provocadas por larvas de
A. simplex
,
Pseudoterranova decipiens
(Krabbe, 1878)
Gibson, 1983 y
C. osculatum
en el estómago de un
ejemplar de
Phoca vitulina
Linnaeus, 1758
.
Vik
(1964) comunicó el hallazgo de larvas de
anisákidos provocando úlceras crateriformes en el
estómago de ejemplares adultos de la marsopa
común,
Phocaena phocaena
(Linnaeus, 1758)
Recientemente, Marcer
et al
. (2020) señalaron que
Sulcascaris sulcata
Rudolphi, 1819, un anisákido
parásito de la tortuga marina
Caretta caretta
(Linnaeus, 1758), provoca gastritis ulcerativa de
alta intensidad. Biolé
et al
. (2012) reportaron la
presencia de
C. australe
en el proventrículo de
Phalacrocorax brasilianus
(Gmelin, 1789)
produciendo invasión a la mucosa digestiva. Todos
estos antecedentes reflejan claramente que, en sus
hospedadores definitivos, los anisákidos
habitualmente tienden a perforar la pared digestiva,
preferentemente gástrica, de todas las especies,
sean teleósteos, condrictios, reptiles, aves o
mamíferos. Una conducta mantenida a lo largo de
toda su radiación adaptativa.
Teniendo en consideración los antecedentes
documentados sobre el potencial infectivo de
larvas de
Contracaecum
spp. en el ser humano, lo
extremadamente rara de su casuística a nivel
mundial y los resultados del presente estudio, nos
permiten concluir que las larvas L del complejo
C.
3
ogmorhini
, de la cavidad visceral de
C. guatucupa
,
solo bajo condiciones altamente definidas podrían
provocar patología en el ser humano como para ser
considerada una especie zoonótica. Tales
condiciones se pueden sintetizar, entre otras, que
las larvas estén vivas al momento de ser ingeridas,
que invadan naturalmente la musculatura de los
peces, que la carne esté cruda o poco cocida y que el
hospedador posea un perfil genético o un estado
inmunológico tal, que sea susceptible a la invasión
tisular.
Los autores expresan su agradecimiento a la
empresa pesquera Costas Argentinas, por su
permanente apoyo y disposición en facilitar los
peces estudiados. El presente trabajo fue realizado
con las siguientes fuentes de financiamiento: PICT-
ANPCyT 20438, PGI-UNS 24/B150 y 24/B183.
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