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ISSN Versión impresa 2218-6425
ISSN Versión Electrónica 1995-1043
Neotropical Helminthology, 2021, 15(2), jul-dic:149-161.
ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL
1
Instituto de Investigaciones Biomédicas “Dr. Francisco J. Triana Alonso” (BIOMED) y Departamento de Parasitología,
Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo Sede Aragua, Venezuela.
2
Departamento de Parasitología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo Sede Carabobo, Venezuela.
3
Instituto de Salud Carlos III, Centro Nacional de Microbiología, Servicio de Parasitología, Majadahonda, Madrid, España.
Alberto Frango-Ramos: https://orcid.org/0000-0002-8301-8374
Ronaldo Delgado: https://orcid.org/0000-0001-6585-0573
Emily Catalano-Donaire: https://orcid.org/0000-0002-6580-2077
Jhon Jesús-Arzapalo: https://orcid.org/0000-0003-1805-8289
Renzo Nino Incani-Cotognini: https://orcid.org/0000-0001-8709-8108
María Jesús Perteguer-Prieto: https://orcid.org/0000-0002-7533-5134
Elizabeth Ferrer-Jesús: https://orcid.org/0000-0002-4173-6642
*Corresponding author: E-mail: elizabeth.ferrer@gmail.com
1112
Alberto Frango-Ramos; Ronaldo Delgado; Emily Catalano-Donaire; Jhon Jesús-Arzapalo;
231
Renzo Nino Incani-Cotognini; María Jesús Perteguer-Prieto & Elizabeth Ferrer-Jesús
*
ABSTRACT
Hookworm is generally caused by
Necator americanus
(Stiles, 1902), causing digestive symptoms and
anemia. The diagnosis by coprology can have low sensitivity, especially in light parasite loads. The
Polymerase Chain Reaction (PCR) is a sensitive and specific technique, which must be adapted to
laboratory conditions and positive controls are necessary. The objective of this work was the
standardization of the PCR technique for the amplification of the ITS-1 sequence of
N. americanus
in
stool samples and its cloning for its use as a control. Three DNA extraction protocols were standardized
(Phenol/chloroform, Saline Precipitation, and Chelex® 100 Resin). Optimal reagent concentrations
(MgCl, BSA, dNTP, primers, and Taq polymerase) were determined, as well as the hybridization
2
temperature and number of cycles. The analytical sensitivity and specificity of the technique was
determined. For cloning, the ITS-1 sequence amplified by PCR was purified and ligated with the vector
pGEM-T-Easy. Competent
E. coli
XL1Blue MRF` cells were transformed with the ligation mixture
(pGEM-T-easy-Na-ITS1), recombinant colonies were identified and plasmid DNA was extracted from
them. The best DNA extraction protocol was phenol / chloroform, the optimal conditions for PCR were;
Neotropical Helminthology
149
doi:10.24039/rnh20211521197
STANDARDIZATION OF THE PCR TECHNIQUE FOR THE DETECTION OF THE ITS-1
SEQUENCE OF
NECATOR AMERICANUS
(STILES, 1902) AND CLONING OF THE
PRODUCT FOR USE AS A CONTROL
ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE PCR PARA LA DETECCIÓN DE LA
SECUENCIA ITS1 DE
NECATOR AMERICANUS
(STILES, 1902) Y CLONACIÓN DEL
PRODUCTO PARA SU USO COMO CONTROL
D
D
D
D
D
D
D
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150
1.5 mM MgCl, 0.5 mg/mL BSA, 100 µM dNTP, 0.6 µM primers, and 1 U
Taq
polymerase, 56 °C
2
hybridization temperature and 40 cycles. The optimal amounts of reagents were less than the amounts
used by other authors, allowing saving of reagents. 100% specificity and an analytical sensitivity of 10 pg
of DNA (extracted from stool samples), and 10 ag of the plasmid (with the cloned sequence) were
obtained, which worked very well as positive control.
La anquilostomiasis es una geohelmintiasis
producida principalmente por las especies
Necator
americanus
(Stiles, 1902)
y
Ancylostoma
duodenale
(Dubini, 1843). Se estima que existen
alrededor de 500 M de personas infectadas por
anquilostomídeos en todo el mundo, donde estos
parásitos causan una pérdida de 3,2 M de años de
vida ajustados por discapacidad anualmente
(Mourão-Dias-Magalhães
et al.
, 2021; WHO,
2020). En la República Bolivariana de Venezuela,
no existen datos recientes oficiales sobre infección
por anquilostomídeos; sin embargo, algunos
estudios demuestran su presencia en poblaciones
diversas con prevalencias que van desde 9 hasta
72% siendo
N. americanus
la especie
INTRODUCTION
predominante (Verhagen
et al.
, 2013; Uzcátegui
et
al.
, 2016; Incani
et al
., 2017).
Los huevos del parásito se desarrollan en el suelo y
liberan larvas que maduran hasta transformarse en
su forma infectante, que pueden penetrar la piel,
migrar y evolucionar hasta alcanzar su hábitat en el
intestino (Haldeman
et al
., 2020). Aunque, se
pueden producir síntomas digestivos y afectar el
estado nutricional, el daño principal se produce por
la pérdida de sangre debido a la succión y
hemorragia, lo que puede causar anemia, cuando
las cargas parasitarias son altas. Debido a esto, se
ha reportado retardo en el crecimiento y déficit
cognitivo en niños, capacidad reducida para el
trabajo en adultos y una variedad de
complicaciones en el embarazo (Verhagen
et al
.,
2013; Haldeman
et al
., 2020; WHO, 2020).
Frango-Ramos
et al.
Keywords:
Cloning
– Diagnosis – ITS-1 –
Necator americanus
– PCR – Standardization
RESUMEN
Palabras clave:
Clonación – Diagnóstico – Estandarización –
ITS-1 –
Necator americanus
– PCR
La anquilostomiasis generalmente se produce por
Necator americanus
(Stiles, 1902),
y ocasiona síntomas
digestivos y anemia. El diagnóstico por coprología tiene sensibilidad baja en las cargas parasitarias leves.
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica sensible y específica, que debe ser adaptada
a las condiciones de laboratorio, donde se necesitan controles positivos. El objetivo de este trabajo fue la
estandarización de la técnica de PCR para la amplificación de la secuencia ITS-1 de
N. americanus
en
muestras de heces y su clonación para el uso como control. Se estandarizaron tres protocolos de extracción
de ADN (Fenol/cloroformo, Precipitación salina, y Resina Chelex® 100). Se determinaron las
concentraciones óptimas de reactivos (MgCl, BSA, dNTP, cebadores, y Taq polimerasa), así como, la
2
temperatura de hibridación y número de ciclos. Se determinó la sensibilidad y especificidad analítica de la
técnica. Para la clonación, la secuencia ITS-1 amplificada por PCR, se purificó y se ligó con el vector
pGEM-T-Easy. Se transformaron células competentes
E. coli
XL1Blue MRF` con la mezcla de ligación
(pGEM-T-easy-Na-ITS1), se identificaron las colonias recombinantes y luego se extrajo el ADN
plasmídico. El mejor protocolo de extracción de ADN fue el fenol/cloroformo, las condiciones óptimas de
la PCR fueron; MgCl 1,5 mM, BSA 0,5 mg/mL, dNTP 100 µM, cebadores 0,6 µM, y Taq polimerasa 1 U,
2
56 °C de temperatura de hibridación y 40 ciclos. Las cantidades óptimas determinadas de los reactivos
permitieron ahorro de los mismos. Se obtuvo 100% de especificidad y una sensibilidad analítica de 10 pg
de ADN (extraído de muestras de heces) y 10 ag del plásmido (con la secuencia clonada), que funcionó
como control positivo.
Neotropical Helminthology, 2021, 15(2), jul-dic
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151
En cuanto al diagnóstico, las técnicas
parasitológicas son económicas y de fácil empleo,
pero son poco sensibles, especialmente, cuando las
cargas parasitarias son bajas. Las técnicas
inmunológicas se ven afectadas por reacciones
cruzadas, disminuyendo su especificidad y suelen
ser poco sensibles debido a la baja respuesta
inmunológica del hospedador (Incani
et al
., 2017).
El uso de pruebas moleculares basadas en la
amplificación de ADN, como la PCR, son útiles en
el diagnóstico por su alta sensibilidad y
especificidad y permiten un diagnóstico especie-
específico (Dacal
et al
., 2020). Para la detección de
ADN de
N. americanus
han sido usadas varias
dianas de amplificación, entre ellas los
espaciadores transcritos internos 1 y 2 (ITS-1 e
ITS-2, del inglés “Internal Transcribed Spacer” 1 y
2) que demuestran buenos índices diagnósticos
(Verweij
et al
., 2007; Basuni
et al.
, 2011; Phuphisut
et al
., 2014).
Para la adecuada utilización de toda técnica de
PCR, se requiere una previa estandarización para
obtener las condiciones óptimas de reacción de
cada laboratorio (Ferrer
et al
., 2015; Romero
et al
.,
2018). Por otro lado, para la técnica se requieren
controles positivos, tradicionalmente obtenidos a
partir de muestras de heces de pacientes, que son
muy variables en cuanto a presencia y cantidad de
sustancias que pudiesen ser inhibidoras de la PCR.
La tecnología del ADN recombinante permite la
clonación de diversas secuencias que
posteriormente se pueden utilizar como controles
positivos (Camacho
et al
., 2016; Pacheco
et al
.,
2019). El objetivo de este trabajo fue la
estandarización de la técnica de PCR para la
amplificación de la secuencia ITS-1 de
N.
americanus
en muestras de heces y la clonación de
la misma para su uso como control.
Muestras biológicas
Se empleó, como fuente de ADN del parásito,
muestras de heces de pacientes diagnosticados por
la identificación de huevos de anquilostomídeos,
detectados por coprología, utilizando las técnicas
directas con solución salina y lugol, Kato y Kato-
Katz, (n=40), para la estandarización y evaluación
MATERIALES Y MÉTODOS
de la sensibilidad analítica de la PCR. Asimismo,
también se determinó la sensibilidad analítica a
partir de ADN plasmídico con el producto de PCR
clonado.
Para la determinación de la especificidad analítica
de la PCR se utilizaron muestras de ADN de otros
helmintos parásitos tales como:
Ascaris
lumbricoides
Linnaeus, 1758,
Toxocara canis
Werner, 1782,
Schistosoma mansoni
Sambon,
1907,
Fasciola hepatica
Linnaeus, 1761,
Taenia
solium
Linnaeus, 1758 y
Taenia saginata
Goeze,
1782. Además, se empleó ADN de protozoarios
(
Trypanosoma cruzi
Chagas, 1909,
Leishmania
chagasi
Cunha & Chagas, 1937 y
Toxoplasma
gondii
(Nicolle & Manceaux, 1908) y ADN
humano.
Técnicas de extracción de ADN
Se colocó 300 µL de una suspensión de heces (con
huevos del parásito) en tubos de 1,5 mL, se les
agregó 300
μ
L de tampón de lisis (Tris-HCL 50
mM pH 8, EDTA 10 mM pH 8, SDS 1%,
Polivinilpolipirrolidona 2%) y se mezcló.
Posteriormente se añadieron 5
μ
L de Proteinasa K
(20 mg/mL) a cada tubo y se incubó a 55 ºC durante
4 h. Se centrifugaron a 14.000 rpm por 15 min, y los
sobrenadantes se trasvasaron a tubos nuevos para
continuar la extracción, tanto por la técnica del uso
de solventes orgánicos (Fenol/Cloroformo), como
por la técnica de precipitación salina, ambas
descritas por Sambrook & Russell (2001). Por otro
lado, también se realizó la extracción usando la
resina Chelex®100 (BioRad, USA), para lo cual;
se colocó 300 µL de una suspensión de heces en un
tubo de 1,5 mL, se añadió 300 µL de tampón de lisis
(Tris-HCl 50 mM pH 8, EDTA 10 mM pH 8, SDS
1% Polivinilpolipirrolidona 2%), 200 µL de
Chelex-100® (BioRad, USA) al 5% y 2,5 µL de
proteinasa K (20 mg/mL) (Pierce, USA), para
continuar la extracción según las instrucciones del
fabricante.
Electroforesis de ADN
La electroforesis de ADN fue realizada de acuerdo
con el procedimiento descrito por Sambrook &
Russell (2001), con las modificaciones descritas
por Romero
et al
.
(2018).
Estandarización de la PCR para la detección de
la secuencia ITS-1 de
N. americanus
La PCR para la amplificación de la secuencia del
Necator americanus
ITS-1-PCR standardization and ITS-1 cloning
Neotropical Helminthology, 2021, 15(2), jul-dic
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152
espaciador intergénico 1 (ITS-1, del inglés,
Intergenic Transcribed Spacer) del ADN ribosomal
de
N. americanus
se realizó, usando muestras de
ADN extraídas de heces con huevos del parásito.
Las reacciones de amplificación fueron realizadas
según Phuphisut
et al
. (2014) empleando los
cebadores; directo, Na-ITS1-D 5´-
ATGCTTGGCAAGAGTCGTTT-3´ y el reverso,
Na-ITS1-R 5´- TGTTGGCGTCCACACATATT-
3´ (Sigma, USA), variando las concentraciones de
los diferentes reactivos y las condiciones del
programa de PCR, para obtener el producto de PCR
esperado de 330 pb de
N. americanus
. Para la
estandarización de la técnica se estudiaron las
siguientes condiciones:
Cantidad de ADN:
Para obtener las cantidades de ADN a evaluar [100
nanogramos (ng), 10 ng, 1 ng, 100 picogramos
(pg), 10 pg, 1 pg, 100 femtogramos (fg), 10 fg, 1 fg]
se realizaron diluciones de la mezcla de los ADN
extraídos de las muestras de heces con huevos de
anquilostomídeos.
Concentración de reactivos:
Cloruro de Magnesio (MgCl) (Promega, USA), se
2
evaluaron las concentraciones de 1 mM, 1,5 mM, 2
mM y 2,5 mM. Albúmina sérica bovina ó BSA (del
inglés,
Bovine Serum Albumin
), se probaron las
concentraciones de 0,5 mg/mL,1 mg/mL, 1,5
mg/mL y 2 mg/mL). Desoxinucleótidos tri-fosfato
(dNTPs) (Promega, USA), se analizaron las
concentraciones de 100 µM, 150 µM, 200 µM y
250 µM. Cebadores, se estudiaron las
concentraciones de 0,2 μM, 0,4 μM, 0,6 μM y 0,8
μM
.
Taq
ADN polimerasa (Promega, USA), se
utilizaron las cantidades de 0,5 U, 0,75 U, 1 U y
1,25 U.
Condiciones (temperatura de hibridación y número
de ciclos) del Programa de amplificación:
Las condiciones ensayadas fueron la
desnaturalización inicial a 95 ºC por 5 min, y
30/35/40 ciclos de los procesos de:
desnaturalización (95 °C, 40 seg), hibridación
(50/53/56 °C, 30 seg) y extensión (72° C, 1 min).
Finalizando con una extensión a 72ºC por 5 min. La
PCR se llevó a cabo en un termociclador C1000
Thermal Cycler (BioRad, USA). Se incluyó
controles negativos (mezcla de reactivos sin ADN)
y controles positivos (ADN del parásito). Los
productos de PCR fueron visualizados en geles de
agarosa al 2 % y el tamaño de las bandas obtenidas,
fue comparado con el tamaño de las bandas de los
marcadores moleculares.
Determinación de la sensibilidad analítica y la
especificidad de la PCR
Se hicieron curvas de titulación con diferentes
cantidades de ADN (de 100 ng a 1 fg), para
determinar la sensibilidad analítica (menor
cantidad de ADN en la que se obtiene
amplificación). La especificidad se determinó
utilizando ADN humano, y de diferentes helmintos
y protozoarios parásitos (
A. lumbricoides
,
T. canis,
S. mansoni
,
F. hepatica, T. solium, T. saginata, T.
cruzi
,
L. chagasi
y
T. gondii)
.
Purificación de los productos de PCR
Las bandas de ADN obtenidas fueron cortadas del
gel y purificadas utilizando el estuche comercial
Wizard ® SV Gel and PCR Clean-Up System
(Promega Corporation, Madison, Wisconsin,
USA) siguiendo las indicaciones del fabricante.
Formación de los ADN recombinantes
Los productos de PCR purificados se ligaron con el
vector pGEM®-T Easy utilizando 1 U de ADN
ligasa de T4. Se empleó una relación plásmido-
inserto de 1:5 y 1:10. La incubación se realizó a 4
°C durante 12 h.
Preparación y transformación de células
competentes
E. coli
XL1-Blue MRF´
Las células competentes
E. coli
XL1Blue se
prepararon según el protocolo descrito por Pacheco
et. al
. (2019). Posteriormente, a alícuotas de 200
µL de células competentes se les agregaron las
mezclas de ligación para transformarlas mediante
choque térmico (30 min 4°C, 90 seg 42 °C, 2 min 4
°C). Se agregó 800 µL de medio Luria Bertani (LB)
precalentado a 42 °C. Los tubos se incubaron a
37°C, 200 rpm durante 1 y se sembraron 200 µL
h
de las células transformadas en placas de LB agar-
Ampicilina (100 µg/mL), las cuales se incubaron a
37°C durante 12 h, para posteriormente observar el
crecimiento de las colonias.
Identificación de las colonias recombinantes
mediante PCR
de colonias
Una pequeña porción de cada colonia se colocó en
25 µL de mezcla de reacción para PCR, empleando
los cebadores del vector y las condiciones de
reacción determinadas como óptimas en la
Frango-Ramos
et al.
Neotropical Helminthology, 2021, 15(2), jul-dic
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153
estandarización. El resultado se evidenció por
electroforesis en gel de agarosa como se mencionó
anteriormente.
Extracción del ADN plasmídico
de las colonias
recombinantes y su uso como control positivo en
la PCR estandarizada
.
Las colonias que dieron positivas a la PCR se
cultivaron en medio LB con ampicilina (100
µg/mL) para la extracción del ADN plasmídico
(ADNp), según el protocolo descrito por Pacheco
et al
. (2019). Posteriormente, se realizó la PCR con
las condiciones de reacción determinadas como
óptimas en la estandarización y utilizando como
ADN molde 1 µL de los ADN plasmídicos
obtenidos. El resultado se analizó en geles de
agarosa de la forma mencionada anteriormente.
Aspectos éticos
El proyecto fue aprobado por el Comité de Bioética
del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la
Universidad de Carabobo (BIOMED-UC),
siguiendo los “Lineamientos Operativos de los
Comités de Ética que Revisan la Investigación
Biomédica (TDR/PRD /ETHICS/2000.1). Se
firmó un consentimiento informado por escrito por
parte de los participantes y de los padres o tutores
(en el caso de los niños) para la obtención de
muestras de heces siguiendo pautas éticas, en el
que todos firmaron estar de acuerdo en que el
remanente de sus muestras de heces se usara para
fines de investigación.
Extracción de ADN
En cuanto a los procedimientos de extracción de
ADN, se hicieron a partir de 40 muestras de heces
de pacientes infectados por anquilostomídeos
detectados mediante coprología, con las técnicas
directas con solución salina y lugol, Kato y Kato-
Katz (las muestras tenían desde 20 hasta 560
huevos/g de heces). Se evaluó cantidad, pureza e
integridad del ADN de cada extracción. En
comparación con las técnicas de precipitación
®
salina y resina Chelex 100 se observó que con la
técnica Fenol-Cloroformo se obtuvo una mayor
cantidad, mejor grado de pureza y una mejor
integridad del ADN, ya que se observó poca
degradación y ADN de gran tamaño, mientras que
RESULTADOS
con la técnica de precipitación salina se obtuvo
ADN en poca cantidad y mediante la extracción
®
con resina Chelex 100 se obtuvo ADN de poca
pureza y muy degradado (Datos no mostrados).
Estandarización de la Técnica de PCR
En la estandarización de la PCR para amplificar la
secuencia ITS-1 de
N. americanus
se usó como
molde el ADN extraído a partir de la técnica Fenol-
Cloroformo (se hizo una mezcla de las muestras de
ADN para tener una muestra homogénea y en
suficiente cantidad para toda la estandarización y
clonación).
Para la determinación de la concentración óptima
del cloruro de magnesio (MgCl), se obtuvieron
2
bandas del tamaño esperado, nítidas y bien
definidas para las concentraciones 1,5 mM, 2 mM y
2,5 mM (Figura 1A), a diferencia de la
concentración de 1mM donde la banda es tenue.
Para los ensayos posteriores se decidió usar la
concentración de 1,5 mM. En la estandarización de
la concentración óptima de BSA, se obtuvieron
bandas nítidas para la concentración de 0,5 mg/mL,
siendo esta la concentración óptima, en
comparación con las concentraciones de 1 mg/mL;
1,5 mg/mL y 2 mg/mL donde se observaron bandas
poco definidas (Figura 1B).
Para la estandarización de los dNTPs se observó
mejor amplificación para la concentración de 100
µM, a diferencia de las bandas observadas en las
concentraciones de 150 µM, 200 µM y 250 µM,
con amplificación incipiente (Figura 1C). En
cuanto a la concentración de cebadores, usando 0,6
µM se obtuvieron las bandas bien definidas,
intensas, siendo esta la concentración óptima para
la PCR. Por el contrario, para las concentraciones
0,2 µM y 0,4 µM las bandas fueron tenues,
mientras que no hubo amplificación a 0,8 µM
(Figura 2A). Para la estandarización de la
Taq
polimerasa se obtuvieron bandas poco definidas
para 0,5 U; 0,75 U y 1,25 U, observándose mejor
amplificación para 1 U, siendo esta la
concentración a usar para la PCR (Figura 2B).
En la estandarización de la temperatura de
hibridación se obtuvieron bandas óptimas a 53 ºC,
en comparación con las bandas observadas a las
temperaturas de 50 ºC y 56 ºC (Figura 2C). Para la
estandarización del número de ciclos, las mejores
bandas se observaron con 40 ciclos, ya que se
Necator americanus
ITS-1-PCR standardization and ITS-1 cloning
Neotropical Helminthology, 2021, 15(2), jul-dic
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154
evidencia bandas tenues a 35 ciclos, mientras que
para 30 ciclos no hubo amplificación (Figura 2D).
Determinación de la sensibilidad y especificidad
de la técnica de PCR estandarizada
Una vez estandarizada la técnica de PCR, se
determinó la sensibilidad y especificidad analítica
empleado las condiciones óptimas obtenidas. La
sensibilidad analítica se evaluó a partir de
diferentes cantidades de ADN extraído de las
muestras de heces de pacientes infectados por
anquilostomídeos, siendo la concentración mínima
de ADN que produjo amplificación de 10 pg, el
equivalente a dos huevos del parásito,
aproximadamente (Pilotte
et al
.,
2016) (Figura
3A). Al realizar una PCR para la secuencia ITS-1
de
N. americanus
usando como muestras ADN de
N. americanus
y otros parásitos relacionados, así
como ADN humano, se obtuvo una especificidad
analítica del 100% (Figura 3B).
Figura 1.
Electroforesis en gel de agarosa de la amplificación de ADN de
N. americanus
en muestras controles. (A) Evaluación de
las concentraciones de MgCl(B) Evaluación de las concentraciones de BSA (C) Evaluación de las concentraciones de dNTPs.
2,
(M) Marcador de tamaño molecular
100 pb plus DNA ladder, Promega
. (C+1) Control positivo 1 y (C+2) Control positivo 2, ADN
de muestras de heces de pacientes con huevos de anquilostomídeos. (C-1) Control negativo 1 y (C-2) Control negativo 2, mezclas
de reacción sin ADN.
Frango-Ramos
et al.
Neotropical Helminthology, 2021, 15(2), jul-dic
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155
Clonación de la secuencia ITS-1 de
N.
americanus
Se realizó la purificación del producto de PCR ITS-
1 de
N. americanus
(330 pb) para su clonación, una
vez purificado el producto, se observó su calidad en
gel de agarosa al 2% (Figura 3C). Posteriormente
se realizó la ligación con el vector pGEM-T-Easy,
la cual fue exitosa, al igual que la transformación de
las células competentes, ya que crecieron 10
colonias. Al verificar la presencia del inserto por
PCR de colonias, se observó la banda del tamaño
esperado (aproximadamente 500 pb,
correspondiente a la suma de 330 pb del inserto y
170 pb de la secuencia del sitio de policlonaje del
vector, ya que se emplearon los cebadores del
vector), en 8 de ellas, mientras que en las 2 colonias
restantes, en una se obtuvo un producto de
amplificación de un tamaño menor y en la otra no
hubo amplificación, indicando que no poseían la
secuencia ITS1 insertada (Figura 3D). Se extrajo
ADN plasmídico de las ocho colonias
recombinantes, y se utilizó el ADN plasmídico para
determinar la sensibilidad analítica de la PCR
estandarizada y se obtuvo una sensibilidad
analítica de 10 attogramos (ag) (Figura 3E).
Necator americanus
ITS-1-PCR standardization and ITS-1 cloning
Figura 2.
Electroforesis en gel de agarosa de la amplificación de ADN de
N. americanus
en muestras controles. (A) Evaluación de
las concentraciones de Cebadores. (B) Evaluación de las concentraciones de
Taq
polimerasa. (C) Evaluación de la temperatura de
hibridación. (D) Evaluación del número de ciclos. (M) Marcador de tamaño molecular
100 pb
plus DNA ladder
,
Promega
. (C+1)
Control positivo 1 y (C+2) Control positivo 2, ADN de muestras de heces de pacientes con huevos de anquilostomídeos. (C-1)
Control negativo 1 y (C-2) Control negativo 2, mezclas de reacción sin ADN.
Neotropical Helminthology, 2021, 15(2), jul-dic
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156
Detección de ADN de
N. americanus
en
muestras de heces de pacientes infectados
mediante la técnica de PCR estandarizada
Se utilizaron los ADN plasmídicos extraídos en la
PCR estandarizada para el diagnóstico de la
secuencia ITS-1 de
N. americanus
. Nuevamente se
obtuvo las bandas diagnósticas características que
presentaban el fragmento del tamaño esperado,
tanto para el ADN extraído de muestras de heces de
pacientes infectados por anquilostomídeos, como
para las diluciones 1/100, 1/1000 y 1/10000 de los
controles positivos (Plásmidos pGEM-T-Easy-
ITS1).
Figura 3.
Electroforesis en gel de agarosa de la amplificación de ADN de
N. americanus.
(A) Sensibilidad analítica de la técnica
de PCR utilizando muestras de heces de pacientes con huevos de anquilostomídeos
.
(1-9):
Concentración de ADN; 100 ng, 10 ng,
1 ng, 100 ρg, 10 ρg, 1 ρg, 100 fg, 10 fg, 1fg, (10) control negativo. (B) Especificidad de la técnica de PCR usando muestras de ADN
de diferentes fuentes
(1)
Necator americanus,
(2)
Ascaris lumbricoides,
(3)
Toxocara canis
(4)
Schistosoma mansoni,
(5)
Fasciola hepatica,
(6)
Taenia solium,
(7)
Taenia saginata,
(8)
Trypanosoma cruzi
, (9)
Leishmania chagasi
,
(10)
Toxoplasma
gondii
(11)
Homo sapiens
, (12) Control negativo. (C) ADN purificado a partir de gel. (D) PCR de las colonias recombinantes. (E)
Sensibilidad analítica de la técnica de PCR utilizando la secuencia clonada. (M) Marcador de tamaño molecular
100 pb
plus DNA
ladder
,
Promega
. (1-14):
Concentración de ADN; 1 µg, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 ρg, 10 ρg, 1 ρg, 100 fg, 10 fg, 1fg, 100 ag, 10 at, 1
ag, (15) control negativo.
Frango-Ramos
et al.
Neotropical Helminthology, 2021, 15(2), jul-dic
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157
A nivel mundial, las técnicas coprológicas para el
diagnóstico de anquilostomiasis son las más
utilizadas; sin embargo, presentan baja
sensibilidad, especialmente en los casos de
infecciones ligeras, donde al haber menor cantidad
de huevos en las heces, hay menos probabilidad de
detectarlos por las técnicas coprológicas.
Asimismo, las técnicas inmunológicas presentan
una baja especificidad debido a reacciones
cruzadas con otros parásitos relacionados. Una
alternativa son los ensayos de PCR, donde
múltiples investigaciones demuestran que es una
técnica que presenta una mayor sensibilidad que
las técnicas coprológicas y mayor especificidad
que las técnicas inmunológicas (Wang
et al
., 2012;
Arndt
et al
., 2013; Dacal
et al
., 2020).
El aislamiento de ADN de alta calidad es esencial
para realizar un buen diagnóstico mediante la
técnica de PCR, ya que cualquier análisis basado en
el ADN requiere una previa extracción, de ahí a que
la optimización de una técnica donde se obtenga
ADN puro e íntegro sea importante (Mikaeili
et al
.,
2013; Ayana
et al
., 2019).
Las extracciones de ADN, de las muestras de heces,
con Fenol-Cloroformo, proporcionó mayor calidad
y cantidad de ADN en comparación con las otras
técnicas, estos resultados concuerdan con lo
reportado por Incani
et al
. (2017) en un trabajo de
PCR en Tiempo Real, donde las extracciones de
ADN a partir de heces, se realizaron por la técnica
de Fenol-Cloroformo. Mediante la técnica de
precipitación salina se obtuvo menor cantidad de
ADN con degradación media, mientras que con
Chelex®100 se obtuvo ADN en mayor proporción,
pero degradado y contaminado con proteínas y
otros elementos orgánicos; así mismo, la
naturaleza de la muestra de heces es un factor
importante, debido a que presenta gran variabilidad
y muchas sustancias que pueden causar
interferencia en las técnicas de PCR (Bosch
et al
.,
2005; Paul
et al
., 2020; Mthethwa
et al
., 2021).
Los estudios en general recomiendan la utilización
de otras técnicas de extracción debido a que el fenol
es una sustancia que se oxida con rapidez,
produciendo vapores tóxicos (Ferrer
et al
., 2008;
Ayana
et al
., 2019, Mthethwa
et al
., 2021). Sin
DISCUSIÓN
embargo, mediante Fenol-Cloroformo se obtuvo
menor degradación en comparación con las otras
técnicas, además de que la calidad del ADN
extraído permitió obtener fragmentos de gran
tamaño, favorables para lograr una buena
amplificación de la secuencia ITS-1 de
N.
americanus
. Por ende, para la estandarización de la
técnica de PCR se usó el ADN extraído mediante la
técnica de Fenol-Cloroformo.
Es importante que para la técnica de PCR exista
una previa estandarización, adaptación y
evaluación, ya que dependiendo del laboratorio
varían las condiciones de reacción, marcas de los
reactivos y equipos (Ngui
et al
., 2012; Phosuk
et
al
., 2013; Phuphisut
et al
., 2014; Incani
et al
.,
2017). Para la estandarización de la técnica de PCR
para la amplificación de la secuencia ITS-1 de
N.
americanus
se variaron las concentraciones de los
diferentes reactivos, temperaturas de hibridación y
número de ciclos, con lo cual se logró obtener las
condiciones óptimas de la reacción.
En cuanto a la concentración de MgClse obtuvo en
2
el presenten trabajo que la concentración óptima es
de 1,5 mM, mientras que fueron mayores para Ngui
et al
. (2012), Phosuk
et al
. (2013) y Phuphisut
et al
.
(2014), las cuales fueron de 2,5 mM, 1,8 mM y 2
mM, respectivamente. En la presente
investigación, se decidió usar la concentración de
1,5 mM, ya que las bandas obtenidas con 1,5 mM, 2
mM y 2,5 mM fueron muy similares y al no haber
diferencias en los resultados de las tres
concentraciones y usar la menor cantidad de
reactivo, se ahorra y se disminuyen, a su vez, los
costos del ensayo. Por otro lado, en las reacciones
de amplificación siempre es mejor usar la
concentración necesaria, porque mientras menos
moléculas sobrantes, menos interferencia y se da
mejor la reacción (Sambrook & Russel, 2001).
La concentración de BSA óptima fue de 0,5
mg/mL, menor que la obtenida por Incani
et al
.
(2017) de 8 mg/mL, que empleó mayor
concentración del reactivo respecto a la presente
investigación. El BSA cumple la función de
bloquear posibles contaminantes que estén
presentes en las muestras de ADN, pero al ser una
proteína, su exceso en el medio de la reacción,
podría también afectar la actividad de la ADN
polimerasa (Garland
et al
., 2010), de allí la
importancia de determinar su concentración
Necator americanus
ITS-1-PCR standardization and ITS-1 cloning
Neotropical Helminthology, 2021, 15(2), jul-dic
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158
óptima para cada sistema en particular.
Por otra parte, la mejor concentración obtenida
para dNTPs fue de 100 µM, menor que la utilizada
por Ngui
et al
. (2012), Phosuk
et al
. (2013) y
Phuphisut
et al
. (2014) que fue de 250 µM, 200 µM
y 400 µM. En cuanto a la concentración de
cebadores se obtuvo que 0,6 µM fue la óptima para
la amplificación, mientras que Sato
et al
. (2010) y
Wang
et al
. (2012) emplearon 0,8 µM. La mejor
concentración obtenida de Taq polimerasa fue de 1
U, mientras que para Phuphisut
et al
. (2014) fue de
1,25 U, empleando mayor cantidad de enzima, lo
cual puede deberse a las diferentes marcas
comerciales empleadas, que pudiesen tener mayor
o menor actividad. Las concentraciones óptimas de
los diferentes reactivos de la PCR, obtenidas en el
presente trabajo, fueron en menor proporción que
las empleadas en los otros estudios, lo que permite
ahorro de los mismos, disminuyendo el costo de la
técnica.
En cuanto a la temperatura de hibridación la óptima
fue de 53 °C, mientras que, para Wang
et al
. (2012)
y Hung
et al
. (2016) fue de 56 °C y 55 °C,
respectivamente. Se obtuvo que 40 ciclos es lo
óptimo, con respecto a Wang
et al
. (2012) no hubo
variación, mientras que, para Sato
et al
. (2010) y
Basuni
et al
. (2011) fue de 45 y 50 ciclos
respectivamente. Es muy importante determinar
estas condiciones debido a las diferentes marcas de
termocicladores, que puede alcanzar los cambios
de temperatura con mayor o menor rapidez y esto
afecta estos parámetros. El presente caso, al ser
menor el número de ciclos, reduce el tiempo
empleado en el desarrollo de la técnica.
Con respecto a la sensibilidad analítica de la
técnica de PCR para la amplificación de la
secuencia ITS-1 de
N. americanus
, se ensayó un
rango que fue de 100 ng (nanogramos) a 1 fg. Al
utilizar muestras de heces de pacientes que
contenían huevos de anquilostomídeos, la mínima
cantidad de material genético amplificado fue de
10 pg, lo equivalente aproximadamente a dos
huevos del parásito (Pilotte
et al
., 2016). Estos
resultados concuerdan con las investigaciones
realizadas por Monti
et al
. (1998), Verweij
et al
.
(2001), y Phuphisut
et al
. (2014) quienes
obtuvieron resultados similares, demostrando que
la diana ITS1 es muy sensible para el diagnóstico
de
N. americanus
.
De igual manera, también se determinó la
sensibilidad analítica utilizando el producto de
PCR de
N. americanus
clonado (plásmido pGEM-
T-easy-ITS1), en este caso la sensibilidad del
ensayo fue de 10 ag (equivalente a la millonésima
parte de un huevo del parásito), siendo un millón de
veces más sensible. Esta diferencia tan grande se
debe a que en el ADN plasmídico extraído todas las
moléculas contienen la secuencia ITS1 de N.
americanus
, mientras que en el ADN extraído a
partir de muestras de heces hay ADN de células
epiteliales descamadas, de bacterias y de todos los
microorganismos que pudiesen estar en las heces,
con lo cual una mínima cantidad correspondería a
N. americanus
, en caso de estar presente. El
rendimiento de la secuencia clonada permite su uso
para evaluar una gran cantidad de muestras, lo cual
es un gran ahorro, evitando extracciones frecuentes
de ADN a partir de heces para tener controles
disponibles para los ensayos. Otro aspecto
importante que representa mayor ventaja es la
reproducibilidad, al ser una muestra homogénea
(secuencia clonada), evita la variabilidad por las
interferencias que pudiesen estar causadas por
diversos componentes de las heces que pueden
estar en menor o mayor proporción.
Los resultados de los ensayos utilizando ADN de
otros parásitos relacionados y ADN humano
demostraron que la técnica posee una especificidad
del 100%, ya que sólo hubo amplificación para la
secuencia ITS-1 de
N. americanus
, al igual que lo
demostrado por otros investigadores (Monti
et al
.,
1998; Verweij
et al
., 2001; Sato
et al
., 2010; Wang
et al
., 2012; Phuphisut
et al
., 2014) quienes
obtuvieron resultados similares, demostrado ser
una diana muy específica. Aunque la especificad
era ya conocida por reportes previos, siempre es
importante verificarla por la posible variabilidad
genética que pudiese estar presente en diferentes
áreas geográficas.
La técnica de PCR estandarizada en la presente
investigación permite identificar pequeñas
cantidades de material genético de
N. americanus
,
por lo que la PCR es una herramienta valiosa y de
utilidad para el diagnóstico molecular de la
anquilostomiasis.
Tanto para la estandarización, validación y uso de
técnicas moleculares se requiere el uso de controles
positivos, los cuales son un elemento esencial en la
Frango-Ramos
et al.
Neotropical Helminthology, 2021, 15(2), jul-dic
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159
interpretación de los resultados. Estos controles
positivos pueden ser obtenidos a partir de heces de
individuos parasitados, sin embargo, puede haber
gran variabilidad por presencia de interferentes en
las muestras, afectado la reproducibilidad del
ensayo. Por ello, la tecnología de ADN
recombinante es una alternativa útil, que permite
clonar secuencias específicas del genoma de
diferentes organismos, que posteriormente se
pueden utilizar como controles en el diagnóstico
molecular (Chan
et al
., 2016). Al respecto, se han
clonado secuencias para el diagnóstico de virus
(Acevedo
et al
., 2009; Camacho
et al
., 2016;
Navarrete
et al
., 2016), bacterias (Sohni
et al
.,
2008; Gokduman
et al
., 2016) y parásitos (Pacheco
et al
., 2019).
Otro aspecto relevante a destacar en la presente
investigación, es la clonación de la secuencia ITS-1
de
N. americanus
en el plásmido pGEM®-T-Easy
que es un vector que permite la clonación directa de
productos de PCR, estrategia sencilla, que puede
ser verificada mediante PCR de las colonias
recombinantes, como ha sido descrito por otros
autores (Camacho
et al
., 2016; Pacheco
et al
.,
2019).
Los plásmidos recombinantes se probaron en los
ensayos de la PCR estandarizada obteniéndose una
buena amplificación en todos los casos, lo que
significa que el producto clonado puede ser usado
como control positivo de manera exitosa, además
de obtener un suministro constante de material
genético del parásito lo que mejora la
reproducibilidad de la técnica.
Los resultados obtenidos demuestran que la PCR
estandarizada es sensible y específica, y que los
controles positivos funcionan adecuadamente.
Cabe destacar que es la primera vez que se reporta
en Venezuela la estandarización de una técnica
molecular para la identificación de
N. americanus
.
La PCR estandarizada puede ser empleada en
laboratorios de referencia, así como en los
programas de control que se realicen en el país.
Este trabajo fue financiado por los Proyectos
DIPISA-PG-2017-004, Universidad de Carabobo,
Venezuela y Proyecto PI17CIII/00019 del Instituto
de Salud Carlos III, Madrid, España.
Agradecimiento a la Fundación "Tierra Blanca",
Valencia Venezuela, y a la Lcda. Nayeska Méndez,
por su colaboración para la obtención de las
muestras.
Necator americanus
ITS-1-PCR standardization and ITS-1 cloning
AGRADECIMIENTOS
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