Keywords: bioassay – carbofuran – ecotoxicology –
Girardia
– planarians – regeneration.
1 Laboratorio de Invertebrados, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Ricardo Palma, Lima, Perú.
2 Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Ricardo Palma, Lima, Perú.
(*) Este estudio fue presentado en calidad de resumen a las Jornadas Internacionales Rioplatenses de Toxicología y Ecotoxicología realizado el 1
y 2 de junio, 2005 en Montevideo, Uruguay.
7
Neotrop. helminthol., 1(1) , 2007
El uso de plaguicidas en el mundo aumenta en forma desproporcionada cada día, por lo que se necesitan urgente-
mente adecuados agentes bioindicadores. Para una oportuna evaluación del riesgo ambiental de los ambientes
acuáticos dulceacuícolas en Perú, se requiere el empleo de organismos biológicos como la planaria de agua dulce
Girardia festae
(Borelli, 1898) (Tricladida: Dugesiidae). Las planarias son importantes componentes de los ecosiste-
mas límnicos, algunas tienen amplia distribución geográfica, son sensibles a contaminantes, poseen alta capacidad
de regeneración y son de fácil cultivo en el laboratorio. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto subletal
del insecticida carbofurano sobre la regeneración de
G. festae
. Se evaluaron planarias seccionadas en tres niveles
(cefálico, medio y caudal) realizando dos cortes transversales (amputación prefaringeal y postfaringeal) en el plano
dorso-ventral y se individualizaron en un medio control (agua de grifo autoclavada) y en dos diluciones del carbo-
furano (1,17 mg L-1 y 2,34 mg L-1) en envases plásticos de 30 mL. El bioensayo ecotoxicológico se concluyó a 17
días de exposición hasta lograr la regeneración completa de las planarias. La parte media regenerada logró un mayor
porcentaje de crecimiento en el control en comparación con las dos concentraciones de carbofurano. En contraste
se observó la hormesis, en las partes cefálicas y caudales regeneradas, al lograr un mayor porcentaje de crecimiento
en 2,34 mg de carbofurano L-1 en comparación con el control.
Resumen
Abstract
The worldwide use of pesticides disproportionately increases every day. For this reason, appropriated bioindicator
agents are urgently needed. For a suitable environmental risk assessment of freshwater aquatic environment in Peru,
employment of biological organism like freshwater planarian
Girardia festae
(Borelli, 1898) (Tricladida: Dugesiidae)
is required. Planarians are main component of limnetic ecosystems, some are wide geographic distributed, sensitive
to pollutants, capable of regenerating and easily cultured in laboratory conditions. The aim of the current research
was to evaluate the sublethal effects of the insecticide carbofuran on regeneration of
G. festae
. Planarians were sec-
tioned in three levels (head, middle and tail) by performing two transversal cuts (prepharingeal and postpharingeal
amputation) in a dorso-ventral plane. They were individualized in control medium (sterilized tap water) and two
dilutions of carbofuran (1.17 mg L-1 and 2.34 mg L-1) in plastic vessels of 30 mL. Ecotoxicological bioassays were
concluded at 17 days of exposure until to complete planarian regeneration. The regenerate middle part of the pla-
narians in control medium raised a higher percentage of growth compared to the two concentrations of carbofuran.
On the contrary, hormesis in head and tail parts raised a higher percentage of growth in 2.34 mg carbofuran L-1
compared to the control.
Palabras clave: bioensayo – carbofurano – ecotoxicología –
Girardia
– planarias – regeneración.
TRABAJOS ORIGINALES / ORIGINAL ARTICLES
EMPLEO DE LA REGENERACIÓN DE LA PLANARIA DE AGUA DULCE
GIRARDIA FESTAE
(BORELLI, 1898) (TRICLADIDA: DUGESIIDAE) PARA
EVALUAR LA TOXICIDAD DEL CARBOFURANO*
EMPLOYMENT OF REGENERATION OF FRESHWATER PLANARIAN
GIRARDIA FESTAE
(BORELLI, 1898) (TRICLADIDA: DUGESIIDAE) TO
EVALUATE TOXICITY OF CARBOFURAN
José Iannacone 1,2 & Miguel Tejada1
Forma de citar: Iannacone, J & Tejada, M. 2007.
Empleo de la regeneración de la planaria de agua dulce
Girardia festae
(Borelli, 1898) (Tricladida: Dugesiidae) para evaluar la toxicidad del carbofurano.
Neotropical Helmintho-
logy, vol. 1, no. 1, pp. 7-13.
Fecha de recepción: 06 de enero de 2006, fecha de aceptación: 30 de mayo de 2006.
Neotrop. helminthol., 1(1) , 2007
© 2007 Asociación Peruana de Helmintología e Invertebrados Afines (APHIA)
8
Regeneración de la planaria,
Girardia festae
, para evaluar la toxicidad del carbofurano. Iannacone J & Tejada M.
INTRODUCCIÓN
El empleo de los plaguicidas en las prácticas agrícolas
aumenta de forma desproporcionada cada día en el
mundo (Dobšiková, 2003). Muchos plaguicidas pro-
ducen efectos tóxicos en los organismos no objetivos
del control y provocan efectos deletéreos en los eco-
sistemas (Iannacone & Lamas, 2003; Tazza, 2005). Los
plaguicidas pueden producir un impacto negativo en los
ecosistemas agrícolas (Carvalho
et al
., 2005).
El carbofurano (2,3-dihidro-2,2-dimetilbenzofuran-7il-
metilcarbamato, Cl2H15NO3) es un carbamato sistémico
de efecto insecticida, acaricida y nematicida, y con bajo
efecto residual (Verma & Dhillon, 2003; Mascolo
et al
.,
2005; Tazza, 2005). Como resultado de su amplio uso,
se le puede encontrar en el suelo, en las aguas superfici-
ales, en los alimentos y en la fauna silvestre (Dobšiková,
2003). En los ambientes acuáticos, la toxicidad del car-
bofurano es influenciada por las poblaciones microbi-
anas presentes en los sedimentos, puede degradarse en
aguas neutras y moderadamente alcalinas (Mascolo
et
al
., 2005). El carbofurano causa necrosis difusa, desa-
rreglo cordal, individualización de hepatocitos y cam-
bios en el metabolismo de lípidos en peces (Begum &
Vijayaraghavan, 2001; Sarkar
et al
., 2005).
El Phylum Platyhelminthes
(helmintos planos) com-
prende aproximadamente 50 000 especies que habi-
tan una gran variedad de nichos ecológicos (Littlewood
& Bray, 2001). Los Platyhelminthes son considerados
organismos biológicos importantes, por ocupar una
posición clave en la evolución de los metazoarios,
como miembros basales de los bilateralia y por ser el
cuarto pylum animal más grande de la tierra (Newmark
& Sánchez-Alvarado, 2002). Dentro de los Platyhel-
minthes, las planarias dulceacuícolas (Turbellaria: Tri-
cladida) tienen una elevada plasticidad y la habilidad
de regenerar completamente a partir de pequeños
fragmentos (1/279 de un organismo adulto), este
fenómeno es conocido por más de 200 años (Hauser
et al
., 1979; Hauser
et al
., 1980; De Vries & Sluys,
1991; Sanchez-Alvarado
et al
., 2002). El fenómeno
de regeneración morfaláctico epimórfico blastemal en
los modelos con planarias (Gehrke-Friedrich & Haus-
er, 1982; Sánchez-Alvarado, 2000; Salo & Baguna,
2002), provee una única oportunidad de estudiar el
mecanismo de control de la pluripotencialidad celular
de las células madres “
stem cells
” mesenquimales de-
nominadas neoblastos (Newmark & Sánchez-Alvarado,
2000; Newmark & Sánchez-Alvarado, 2002).
Debido a su extraordinaria capacidad para la regene-
ración y para la reproducción asexual, las planarias han
sido empleadas como organismos modelo para estudiar
los mecanismos celulares y moleculares que conducen a
la regeneración tisular (Santos & Hauser, 1984; Hauser
& Santos, 1985; Shinozawa
et al
., 1995; Guecheva
et al
., 2001; Inoue
et al
., 2004; Hwang
et al.
, 2004;
Reddien
et al
., 2004; Sánchez-Alvarado, 1999; Cow-
ard
et al
., 2005). Las planarias son importantes com-
ponentes de los ecosistemas límnicos, algunas tienen
amplia distribución geográfica, son sensibles a contami-
nantes, poseen alta capacidad de regeneración y son de
fácil cultivo bajo condiciones de laboratorio (Nano
et
al
., 2002; Souza & Leal-Zanchet, 2002; Inoue
et al
.,
2004; Sánchez-Alvarado, 2004).
Para la evaluación del riesgo ambiental de los ambientes
acuáticos dulceacuícolas en Perú, se requiere el uso de
adecuados organismos biológicos como la planaria de
agua dulce
Girardia festae
(Borelli, 1898) (Turbellaria:
Dugesiidae). El objetivo del presente trabajo fue evaluar
el efecto subletal del carbofurano (Furadán 4F®) sobre la
regeneración de
G. festae
.
Planarias
La colecta de la planaria de agua dulce
G. festae
se rea-
lizó en el río Lurín, Pachacamac, Lima, Perú (76°46´LW
y 12°05´LS) durante agosto del 2004. Se empleó
como carnada de atracción al hígado fresco de pollo, y
se esperó entre 15-20 min para que las planarias sean
atraídas al atrayente por quimiotaxis. Posteriormente,
los individuos fueron llevados al Laboratorio de Inver-
tebrados de la Facultad de Ciencias Biológicas de la
Universidad Ricardo Palma. En el agua del río Lurín fue
cambiada por agua de grifo declorinada, autoclavada e
hiperoxigenada por 8 h. Las planarias fueron colocadas
individualmente en envases plásticos de 30 mL de capa-
cidad bajo condiciones no controladas de temperatura
fluctuantes entre 22± 4 °C. Las condiciones térmicas
empleadas correspondieron al promedio de temperatura
de la ciudad de Lima, Perú. En el Laboratorio, las pla-
narias fueron alimentadas semanalmente con hígado de
pollo. 48 h previo a los experimentos, las planarias no
se alimentaron (Oviedo
et al
., 2003).
MATERIAL Y MÉTODOS
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Neotrop. helminthol., 1(1) , 2007
RESULTADOS
Figura 1. Capacidad de regeneración en mm
en las tres secciones de corte de
G. festae
en
el control de 0 a 17 días de exposición.
Carbofurano
La solución madre se preparó a partir del Furadán 4F®
(1200 mg IA L-1), (2,3-dihidro-2,2-dimetilbenzofuran-
7il-metilcarbamato; Cl2H15NO3; CAS N° 1563-66-2;
peso molecular = 221,3; solubilidad en agua = 700 mg
L-1; punto de fusión = 153-154°C; dosis de aplicación
= 0,5 a 10 lbs IA acre-1; toxicidad = extremadamente
tóxico; formulación = pasta fluida; clasificación toxi-
cológica = Ia; Registro 103-96-AG-SENASA, Perú),
tomando 2,5 mL del producto y se le agregó 250 mL de
agua de grifo declorinada, autoclavada e hiperoxigenada
por 8 h. Luego a partir de diluciones sucesivas, se obtu-
vieron dos concentraciones: 1,17 mg L-1 y 2,34 mg L-1,
respectivamente. Ambas concentraciones, luego de ser
preparadas fueron almacenadas en envases de plástico
de 250 mL de capacidad. El factor de dilución empleado
para las dos concentraciones fue de 0,5.
Bioensayo
Las tres planarias seleccionadas entre 8,5 a 12,1 mm
de longitud total, fueron seccionadas en tres niveles
(cefálico, medio y caudal) y se realizaron dos cortes
transversales (amputación prefaringeal y posfaringeal)
en el plano dorso-ventral (Oviedo
et al
., 2003). Cada
una de las tres secciones, se individualizaron en 20
mL del medio control (agua de grifo autoclavada) y en
las dos diluciones del carbofurano (1,17 mg IA L-1 y
2,34 mg IA L-1) en envases plásticos de 30 mL de ca-
pacidad cubiertos con papel aluminio. Las soluciones
y los envases fueron renovados semanalmente. El bio-
ensayo ecotoxicológico se concluyó a los 17 días de
exposición hasta lograr la regeneración completa de
las planarias en el control (Piontek, 1984; Inoue
et
al
., 2004). Siete lecturas fueron realizadas a los 5, 7,
8, 9, 13, 16 y 17 días de exposición. En cada lectura
se procedió a extraer a cada planaria y fue colocada en
una lámina portaobjeto de vidrio para ser fotografiada
bajo un microscopio estereoscópico de 10 x de au-
mento. Con el fin de favorecer la inmovilización de las
planarias para una adecuada medición fueron coloca-
das por menos de un minuto a 4 °C de refrigeración.
Finalmente, cada individuo de cada concentración fue
medido por triplicado en cada una de sus tres sec-
ciones en mm con la ayuda de un papel milimetrado.
Durante el bioensayo las planarias de agua dulce no
fueron alimentadas.
Análisis de datos
Se empleó el ANDEVA (Análisis de Varianza), previa
transformación de los datos a logaritmo X+1, con el
fin de ajustar los datos a la distribución normal (Zar,
1996), para determinar si existían diferencias significati-
vas entre los tiempos de exposición (5, 7, 8, 9, 13, 16
y 17 días) y entre los tres niveles seccionados (cefálico,
medio y caudal) de las planarias. En el caso de existir
diferencias significativas se realizó una prueba de signifi-
cación DVS (Diferencia Verdaderamente Significativa)
de Tukey. Se empleó la prueba de Levine para el cálculo
de la homogeneidad de las varianzas. Para el cálculo de
las estadísticas descriptivas e inferenciales se empleó el
paquete estadístico SPSS® v.12,0.
La capacidad de regeneración de
G. festae
fue diferente
entre las dos concentraciones de carbofurano y las tres
secciones evaluadas (Fig. 1 al 3).
10
Regeneración de la planaria,
Girardia festae
, para evaluar la toxicidad del carbofurano. Iannacone J & Tejada M.
Figura 2. Capacidad de regeneración en mm
en las tres secciones de corte de
G. festae
a
1,17 mg carbofurano L-1 de 0 a 17 días de ex-
posición.
Figura 3. Capacidad de regeneración en mm
en las tres secciones de corte de
G. festae
a
2,34 mg carbofurano L-1 de 0 a 17 días de ex-
posición.
Al examinar la sección cefálica de
G. festae
a 1,17 mg
IA L-1 de carbofurano, no encontramos diferencias no-
torias en la regeneración a través de los 17 días de ex-
posición (F = 2,4; p = 0,08) (Fig. 2). En cambio, ex-
istieron diferencias en la sección cefálica en el control (p
= 4,01; p = 0,01) y en 2,34 mg IA L-1 de carbofurano
(F = 5,45; p = 0,004), a los 13 y 8 días, respectiva-
mente. En la sección media de
G. festae
, observamos
diferencias significativas en el control (F = 9,77; p =
0,00), a 1,17 mg IA L-1 (F = 22,17; p = 0,00) y a
2,34 mg IA L-1 de carbofurano (F = 11,04; p = 0,00),
a los 5, 7 y 5 días, respectivamente en comparación con
el día 0. En adición, en la sección caudal de
G. festae
,
observamos diferencias significativas en el control (F =
6,22; p = 0,001), a 1,17 mg IA L-1 (F = 3,73; p =
0,01) y a 2,34 mg IA L-1 de carbofurano (F = 20,55;
p = 0,00), a los 8, 17 y 7 días, respectivamente en
comparación con el día 0. La parte media regenerada
logró un mayor porcentaje de crecimiento en el control
(149,5%) al compararse con las dos concentraciones de
carbofurano (en 1,17 mg L-1 de 90,4% y en 2,34 mg L-1
de 106,4%) a los 17 días de exposición. En contraste,
observamos en las partes cefálicas y caudales regenera-
das, un mayor porcentaje de crecimiento en 2,34 mg
de carbofurano L-1 (sección cefálica = 62,3% y sección
caudal = 93,17%) en comparación con el control (sec-
ción cefálica = 22,6% y sección caudal= 69,7%) y con
la concentración de 1,17 mg de carbofurano L-1 (se-
cción cefálica = 7,3% y sección caudal = 37,6%).
El carbofurano es un plaguicida altamente tóxico para
peces al presentar valores de CL50 (Concentración le-
tal media) menores a 1 mg L-1 (Dobšíková, 2003).
Los resultados del carbofurano sobre el invertebrado
Daphnia magna (Strauss, 1820) difieren en un orden
de magnitud al ser comparados con los resultados de
otros organismos acuáticos (CL50 = 0,047 mg L-1 a 24
h de exposición y CL50 = 0,018 mg L-1 a 48 h de ex-
DISCUSIÓN
11
Neotrop. helminthol., 1(1) , 2007
AGRADECIMIENTOS
posición) (Dobšíková, 2003). Las dos concentraciones
evaluadas de carbofurano sobre
G. festae
en el presente
trabajo se encuentran ligeramente sobre los valores de
CL50 para peces e invertebrados acuáticos registrados
en la literatura científica. Por otro lado, la concentración
ambientalmente esperada de carbofurano en el agua es
de 0,48 mg L-1, menor a las concentraciones empleadas
en el presente estudio sobre
G. festae
.
En el presente estudio se ha observado a los 5 días
de exposición en la sección cefálica del control y en la
concentración de 1,17 mg IA L-1 de carbofurano; así
como, en la sección caudal a 1,17 mg IA L-1 y a 2,34
mg de carbofurano L-1, una disminución en el tamaño
de
G. festae
en comparación con el día 0. Newmark
& Sánchez-Alvarado (2002) atribuyen el fenómeno de
decrecimiento en planarias dulceacuícolas a condiciones
limitantes nutricionales y a que pueden disminuir a un
tamaño que es más pequeño que en el momento de la
eclosión. Considerando que los individuos de
G. festae
no fueron alimentados durante los 17 días del bioen-
sayo, este hecho pudo influenciar que existiera una dis-
minución en algunas lecturas del tamaño de la sección
en comparación a la lectura anterior.
La toxicidad del carbofurano es altamente dependiente
de la duración, frecuencia, intensidad de exposición y
la susceptibilidad del organismo evaluado, siendo este
último influenciado por la edad, sexo, vigor y varia-
ción genética (Trotter
et al
., 1991; Antón
et al
., 1993;
Dobšíková, 2003; Iesce
et al
., 2006). Así, la parte
media regenerada de
G. festae
logró un mayor porcen-
taje de crecimiento estadísticamente significativo en el
control en comparación con la menor concentración de
carbofurano. En contraste, se observó ligeramente una
hormesis, en las partes cefálicas y caudales regeneradas,
al lograr un mayor porcentaje de crecimiento estadísti-
camente significativo en 2,34 mg de carbofurano L-1 en
comparación con el control. Morse (1998) señala que
la hormesis u hormoligosis es el fenómeno por el cual
cantidades pequeñas de un agente estresante, entre el-
los los insecticidas, puede ser útil para un organismo
en ambientes subóptimos, este fenómeno ocurre en nu-
merosos invertebrados.
Shinozawa
et al
. (1995) indica que la regeneración de la
sección cefálica puede ser influenciada por efectos tér-
micos (80°C por 30 min) y sustancias químicas, mientras
que la sección caudal permanece invariable. Nuestros
resultados mostraron que la capacidad de regeneración
de la sección cefálica y caudal en el control y las diferen-
tes concentraciones fue diferente.
Se ha encontrado que la planaria de agua dulce Girardia
tigrina (Girard, 1850) (Tricladida: Turbellaria) es poco
afectada por el resmetrin, temefos y la ciromazina. Sin
embargo, el metopreno y el benzil-1,3 benzodioxole no
provocaron ningún efecto sobre este turbelario (Nelson
et al
., 1994; Villar
et al
., 1994). Debido a la extraordi-
naria capacidad de regeneración de la planaria de agua
dulce,
G. festae
, ésta puede ser un organismo adecuado
para evaluar la ecotoxicidad de plaguicidas, como el car-
bofurano (Sanchez-Alvarado, 2004), en comparación
con peces, invertebrados y algas dulceacuícolas (Antón
et al
., 1993; Dobšíková, 2003; Iesce
et al
., 2006), de-
bido a que son representativos del bentos dulceacuícola,
son sensibles a contaminantes, poseen alta capacidad de
regeneración y son de fácil cultivo bajo condiciones de
laboratorio
Al Dr. Hugo Gonzales, catedrático y Decano de la Fa-
cultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Ricardo
Palma (URP), Lima, Perú por las sugerencias críticas al
presente trabajo.
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José Iannacone
Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad
Ricardo Palma.
Av. Benavides 5440. Santiago de Surco, Lima
33. Lima, Perú.
Correo electrónico: joseiannacone@yahoo.es
Teléfono: (51) - 12573227. Telefax: (051)
- 014600930
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