Forma de citar: Iannacone, J, Alvariño, L & Pérez, D. 2008. Efecto de Paullinia clavigera “Sacha yoco” (Sapindaceae) sobre la
eclosión de huevos de Fasciola hepatica. Neotropical Helninthology, vol. 2, nº2, pp. 54-60.
112
José Iannacone ; Lorena Alvariño ; Diana Pérez
Key words: bioassay – eggs – Fasciola – hatchability – Paullinia - phytochemical screening
Abstract
Employment of plant extracts represent an alternative to integrated parasite management in Public health,
due to its low cost and low impact on environment to conserve biodiversity. Current research aims to
determinate the effect of Amazonian plant soapberry Paullinia clavigera Simpson (Sapindaceae) on
hatchability of Fasciola hepatica L. (Trematoda: Fasciolidae) eggs. Eggs were obtained from cattle
processed at the Yerbateros abattoir, Lima, Peru. A phytochemical screening was done and hexane,
chloroform and hydroalcohol extracts of cortex and leaves of P. clavigera were prepared. Bioassays to
determinate the effect of soapberry on hatchability of eggs were performed; those were incubated on extracts
at 22°±2ºC during 21 days and finally exposed to light for 12 h. Significant differences between number of F.
hepatica eggs exposed to each concentration in bioassays did not exist. The hatching of F. hepatica eggs was
only affected by hexane extract of the cortex of P. clavigera to two higher concentrations. Toxicity observed
on hexane extract of cortex of P. clavigera was noted in the presence of triterpenes, flavonoids and quinones.
Laboratorio de Invetebrados. Museo de Historia Natural. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Ricardo Palma. Correo
electrónico: joseiannacone@gmail.com
Instituto de Investigaciones de la Amazonía Peruana, IIAP-Pucallpa.
1
2
EFECTO DE PAULLINIA CLAVIGERA “SACHA YOCO” (SAPINDACEAE)
SOBRE LA ECLOSIÓN DE HUEVOS DE FASCIOLA HEPATICA
EFFECT OF SOAPBERRY PAULLINIA CLAVIGERA (SAPINDACEAE)
ON HATCHABILITY OF FASCIOLA HEPATICA EGGS
Resumen
La utilización de extractos vegetales representa una alternativa para el manejo integrado de parásitos en
Salud Pública, debido a su bajo costo y al menor impacto sobre el ambiente al conservar la biodiversidad. El
presente trabajo tuvo como objetivo determinar el efecto de los extractos de la planta amazónica Paullinia
clavigera Simpson “Sacha yoco” (Sapindaceae) sobre la eclosión de huevos de Fasciola hepatica L.
(Trematoda: Fasciolidae). Los huevos fueron obtenidos de bovinos procedentes del camal de Yerbateros,
Lima, Perú. Se realizó el tamizaje fitoquímico y se prepararon los extractos hexánico, clorofórmico e
hidroalcohólico a partir de la corteza y hoja de P. clavigera. Se realizaron bioensayos para determinar el
efecto de Sacha yoco sobre la eclosión de los huevos, los cuales fueron incubados en los extractos a 22° ± C
durante 21 días y finalmente expuestos a la luz por 12 h. No existieron diferencias significativas entre el
número de huevos de F. hepatica expuestos en cada una de las concentraciones en los bioensayos. Solo
existió efecto en la eclosión de los huevos de F. hepatica por el extracto hexánico de corteza de P. clavigera a
las dos concentraciones más altas. La toxicidad observada en el extracto hexánico de corteza de P. clavigera
pudiera deberse a la presencia de triterpenos, flavonoides y quinonas.
Palabras claves: bioensayo - eclosión - huevos -Fasciola - Paullinia - tamizaje fitoquímico
Neotrop. Helminthol., 2(2), 2008
2008 Asociación Peruana de Helmintología e Invertebrados Afines (APHIA)
54
INTRODUCCIÓN
Para el mejoramiento de la salud pública y las
actividades pecuarias en el nuevo milenio se deben
establecer nuevas alternativas de control que produzcan
un menor impacto y riesgo ambiental, reduciendo
significativamente el uso de sustancias químicas
sintéticas, las cuales por su elevado costo, también
representan una limitante en su uso (Tchounwou et al.,
1992; Liang et al., 2001).
La toxicidad aguda y la mortalidad son parámetros
toxicológicos de gran importancia al evaluar los
parasiticidas (Iannacone & Alvariño, 2002). En el Perú,
el control químico con sustancias sintéticas es el más
empleado para el control parasitario. El problema de
estos compuestos sintéticos es su capacidad de
bioacumulación, su poder residual prolongado, y su
efecto negativo en los seres humanos (Iannacone &
Alvariño, 2002).
La utilización de extractos vegetales para el control de
parásitos es importante, debido a su bajo costo y al
menor impacto sobre el ambiente al conservar la
biodiversidad (Hansen & Johnson, 1999; Becerra, 2001;
Morley et al., 2001; Vinaud et al., 2005). Se han
evaluado las propiedades biocidas de Paullinia
clavigera Simpson (Sapindaceae) sobre Anopheles
benarrochi Gabaldon, Cova García y Lopez 1941
(Diptera) (Pérez & Iannacone, 2004), Rhynchophorus
palmarum L. (Pérez & Iannacone, 2006), Daphnia
magna Strauss, 1820 (Iannacone et al., 2007),
Chrysoperla externa (Hagen, 1861) (Iannacone et al.,
2007), Copidosoma koehleri Blanchard, 1940
(Iannacone et al., 2007), Thuthillia cognatha
Hodkinson, Brown & Burckhardt, 1986 (Pérez et al.,
2008), Eupalamides cyparissias Fab (Pérez &
Iannacone, 2008), Chironomus calligraphus Goeldi,
1905 (Iannacone & Pérez, 2008) y Artemia franciscana
Kellog, 1906 (Iannacone & Pérez, 2008). En la especie
congenérica a P. clavigera, Paullinia pinnata L. se han
registrado actividades molusquicidas (Abourashed et
al., 1999; Melendez & Carriles, 2002). En Paullinia
cupana Kunth “Guarana” se ha evaluado su importancia
como remedio herbal natural y etnobotánico, y como
fuente de plaguicida biodegradable (Myerscough,
1998). Extractos acuosos de P. cupana han mostrado
actividad genotóxica y mutagénica en Escherichia coli
(Da Fonseca et al., 1994). Altas concentraciones de
cafeína se han encontrado en Paullina yoco Schultes &
Killip y P. cupana (Schultes, 1994; Cipollini 2000;
Weckerle et al., 2003). Paullinia clavigera es una planta
amazónica promisoria como biocida, por lo que, para
una adecuada evaluación biológica, se requiere el
empleo de bioensayos toxicológicos (Hansen &
Johnson, 1999; Nano et al., 2002).
La fasciolosis causada por el trematodo Fasciola
hepatica L. en los animales domésticos, puede producir
grandes pérdidas económicas que van desde el decomiso
de los hígados hasta la disminución del peso, retraso del
crecimiento, reducción de la producción de carne, leche
o lana, descenso de la resistencia a otras enfermedades,
inhibición de la reproducción, abortos e inclusive la
muerte (Becerra, 2001; Romero et al., 2002).
La fasciolosis humana es un problema significativo de
Salud Pública a nivel mundial (Romero et al., 2002).
Estudios recientes indican que 2,4 a 17 millones de
personas a nivel mundial están infectadas (Becerra,
2001). A pesar que la mortalidad debido a fasciolosis es
relativamente baja, infecciones masivas o repetidas
pueden producir una considerable morbilidad
(Favennec et al., 2003). Registros en humanos
infectados con F. hepatica han incrementado
significativamente a nivel mundial desde 1980. Varias
áreas son realmente endémicas, con características
epidemiológicas singulares. Una característica en esta
enfermedad es estar asociada a regiones altitudinales
muy altas, al menos en Sudamérica (Romero et al.,
2002). Este parásito causa severas sintomatologías y
patologías en niños (Esteban et al., 2002; Saba et al.,
2004). Los focos de transmisión de la fasciolosis están
marcados por la presencia de poblaciones de caracoles
limneidos en cuerpos de agua (Fuentes et al., 1999). El
éxito de la infección de un trematodo a un caracol de
agua dulce depende de al menos tres factores
principales: la edad del caracol en la exposición, la
temperatura del agua en donde se localizan el caracol y el
miracidio, y la nutrición del caracol (Abrous et al.,
2001). La producción de huevos de F. hepatica puede
ser rítmica, la eclosión pudiera ocurrir espontáneamente
en el agua, pero la luz, la presión osmótica y la
temperatura parecen ser señales importantes para la
eclosión (Valenzuela & Quintana, 1998; De Souza et al.,
2002; Sukhdeo & Sukhdeo, 2004; Hassan et al., 2008).
En la lucha para el control de trematodos y de sus
hospederos intermediarios se han empleado extractos
vegetales con propiedades ovicidas (De Carvalho et al.,
1998), miracidicidas (De Carvalho et al., 1998;
Mohamed et al., 2005; Vinaud et al., 2005), cercaricidas
(Frischkorn et al., 1978; Monkiedje et al., 1991; Rug &
Ruppei, 2000; Naples et al., 2005), adulticidas (Romero
et al., 2002; Mohamed et al., 2005) y finalmente
molusquicidas (Hosni et al., 1999; Rug & Ruppel, 2000;
Singab et al., 2006).
Para la selección de las especies vegetales, una de las
primeras actividades es la recopilación de las referencias
bibliográficas de los vegetales empleados en el control
de parásitos local e internacionalmente. Además es
prometedor consultar literatura etnobotánica y de
medicina popular (Pérez & Iannacone, 2006). Los
bioensayos se emplean para estudiar las propiedades
parasiticidas de las diferentes partes de las plantas
(raíces, corteza, hojas, frutos, flores, etc.), la eficacia de
55
Efecto del Sacha Yoco en Fasciola hepatica Iannacone J, Alvariño L, Pérez D.
los diferentes extractos y formulaciones, y el modo de
acción de los ingredientes activos; e inclusive un
posterior análisis de mercado. Los bioensayos deben ser
altamente sensitivos a las sustancias bioactivas, fáciles
de manipular, baratos, de amplio espectro y dar rápidos
resultados (Pérez et al., 2008).
El objetivo del presente trabajo fue determinar el efecto
antihelmíntico-ovicida de extractos de corteza y hoja de
P. clavigera sobre la inhibición de la eclosión de huevos
de F. hepatica.
Los bioensayos toxicológicos se realizaron en el
Laboratorio de Invertebrados, Facultad de Ciencias
Biológicas, Universidad Ricardo Palma, Distrito de
Santiago de Surco, Lima, Perú.
Extracto botánico. Las lianas y hojas de P. clavigera
(PC) fueron colectadas del km 83 de la Carretera
Federico Basadre (CFB), Caserío “Señor de los
Milagros”, jurisdicción del distrito de Irazola, Provincia
de Padre Abad, Ucayali, Perú. Las lianas de PC fueron
secadas directamente al sol por espacio de dos semanas
aproximadamente y se trituraron en un molino de
martillo. Se prepararon los extractos hexánico,
clorofórmico e hidroalcohólico según los
procedimientos descritos en el tamizaje fitoquímico. Se
prepararon cuatro concentraciones empleando un factor
de dilución de 0,5, el cual es el empleado en la mayoría
de los bioensayos (Iannacone et al., 2007).
Tamizaje Fitoquímico. La preparación de los extractos
hexánico, clorofórmico e hidroalcohólico y el tamizaje
fitoquímico de la corteza y hoja de P. clavigera siguió lo
descrito por Iannacone et al. (2007).
con renovación de solvente
cada 48 h, el solvente se eliminó hasta sequedad en
rotavapor a presión reducida, de esta forma se obtuvo los
extractos clorofórmicos. Finalmente, al residuo se
adiciona etanol-agua (70:30), solventes polares, y se
procedió como en los casos anteriores, obteniéndose los
extractos hidroalcohólicos.
Fasciola hepatica. Se obtuvieron hígados frescos de
vacunos (Bos taurus L.) parasitados con F. hepatica
procedentes del camal de Yerbatero del Lima, Perú. Los
hígados infectados con adultos de F. hepatica fueron
llevados al Laboratorio de Invertebrados de la Facultad
de Ciencias Biológicas de la Universidad Ricardo
A partir de 100 g de
muestra seca y molida de P. clavigera se extrajo con
hexano (solvente apolar) hasta agotamiento con
renovación de solvente cada 48 h, despúes de eliminar el
solvente en rotavapor a presión reducida se obtuvo los
extractos henicos. Al residuo se le adicio
cloroformo (CHCl ) (solvente medianamente polar) y se
3
extrajo hasta agotamiento
Palma, y los huevos fueron colectados después de una
sedimentación en solución ADAM, cuyas características
fisicoquímicas son las indicadas por Iannacone et al.
(2007). Este procedimiento se repitió de 3 a 5 veces. Los
huevos limpios, posteriormente, fueron suspendidos en
agua de grifo declorinada y se mantuvieron en
refrigeración hasta su empleo en los bioensayos (Rug &
Ruppei, 2000; Liang et al., 2001).
Ensayo de inhibición de la eclosión de los huevos. La
solución de huevos fueron concentrados por
centrifugación hasta una concentración aproximada de
20-45 huevos por 0,1 mL (Hegazi et al., 2007). 0,1 mL
de la solución de huevos se agregó a 2 mL del agua de
grifo declorinada del control y en cada una de las cuatro
concentraciones del extracto botánico: 0,05; 0,1, 0,2 y
-1
0,4 mg L en las placas de 24 pocillos (Multiwett®). Se
incluyó un control por cada uno de los tres solventes
orgánicos empleados. Cuatro repeticiones de cada
concentración fueron preparadas. Todas las pruebas
fueron conducidas en paralelo. Los huevos fueron
incubados a 22°±2ºC durante aproximadamente 21 días,
pero examinando el control cada tres días para verificar
la embrionación y próxima eclosión evidenciada por el
movimiento del miracidio en el interior del huevo, y
luego por 12 h bajo luz de lámpara de tungsteno (60 W)
para inducir la eclosión de los huevos y obtención de los
miracidios. La proporción de huevos eclosionados fue
determinada en cada concentración del extracto
ensayado en 100 huevos contabilizados (Roberts et al.,
1978; Morley et al., 2001). Por motivos logísticos no se
realizó el ensayo de inhibición de eclosión de huevos con
el extracto hexánico de hoja de P. clavigera.
Análisis de datos. Las pruebas de toxicidad de los
extractos hexánico, clorofórmico e hidroalcohólico de
Sacha yoco sobre la inhibición de la eclosión de F.
hepatica se evaluaron considerando cuatro
concentraciones (tratamientos) más el control a base de
agua de grifo declorinada y del solvente, con cuatro
repeticiones, en un diseño de Bloque Completo al Azar
(DBCA): 6 x 4. La eficacia de los tratamientos y las
repeticiones se evaluó a través de un análisis de varianza
(ANDEVA) de dos vías, previa transformación de los
datos a raíz cuadrada del arcoseno. En el caso de existir
diferencias significativas entre los tratamientos y entre
las repeticiones se realizó la prueba de Tukey. Los
cálculos de la inhibición de la eclosión de huevos
corregida se realizó mediante la fórmula de Abbott en
caso que en el grupo testigo fuese menor al 25%
(Macedo et al., 1997). Los resultados fueron analizados
mediante el paquete estadístico SPSS, versión 15,0.
Mediante el tamizaje fitoqmico de los extractos
hexánicos, clorofórmicos e hidroalcóholicos de
MATERIAL Y MÉTODOS
RESULTADOS
56
Neotrop. Helminthol., 2(2), 2008
corteza y hoja de P. clavigera, se obtuvo los resultados
señalados en la Tabla 1. El extracto hexánico de la
corteza presentó: triterpenos, flavonoides y quinonas;
su extracto clorofórmico presentó positividad:
cumarinas, flavonoides, esteroides, saponinas y
quinonas; en cambio el extracto hidroalcolico
presenfenoles, flavonoides, cumarinas, quinonas y
saponinas (Tabla 1). Respecto a la hoja, su extracto
clorofórmico y hexánico presentaron positividad en
esteroides y triterpenos; en cambio el extracto
hidroalcolico presentó flavonoides, cumarinas y
amincidos (Tabla 1).
No existieron diferencias significativas entre el número
de huevos de F. hepatica colocados en los 24 pocitos de
las placas (F = 1,1- 2,6; P = 0,06-0,40). No existieron
diferencias significativas entre las cuatro réplicas con
relación al número de huevos de F. hepatica empleados
en los bioensayos (F = 0,32-0,81; P = 0,51-0,81). Existió
efecto en la inhibición de la eclosión de los huevos de F.
hepatica empleando el extracto hexánico de corteza de
P. clavigera a las dos concentraciones más altas, en
comparación con el control. En el resto de extractos no
existieron diferencias entre los controles con agua de
grifo declorinada y el control con el solvente con las
concentraciones ensayadas (Tabla 2).
La efectividad de un helminticida botánico es
dependiente de algunos factores extrínsecos, tales
como la especie y variedad de la planta, época de
recolección, parte cosechada y forma de preparacn,
concentración y aplicación (Iannacone & Lamas
2003). Las diferencias en la toxicidad de diferentes
extractos (hidroalcohólico, clorormico y hexánico)
de P. clavigera pudieran deberse a la presencia de
inhibidores activos en los extractos o a la presencia de
inhibidores de principios helminticidas. En el presente
estudio se empl agua de grifo declorinada como
control negativo. Solo el extracto de corteza de Sacha
-1
yoco hexánico a 0,2 y 0,4 mg L ocasionó una
disminución significativa en la eclosión de huevos:
56,1% y 50,4%, en comparación con el control que
presen80,2 % de huevos que eclosionaron(Tabla 2).
La toxicidad observada en el extracto hexánico de
corteza de P. clavigera pudiera deberse a la presencia
de triterpenos, flavonoides y quinonas.
La efectividad de un helminticida botánico también
depende de factores inherentes al organismo de prueba,
es de destacar la variación de la susceptibilidad de
acuerdo a la edad y al estado de desarrollo (Rug &
Ruppei, 2000; Mohamed et al., 2005, Vinaud et al.,
2005). Varios autores señalan que el estado helmíntico
acuático menos susceptible de los tremátodos a
sustancias químicas tóxicas es el huevo en comparación
con sus dos estadios de vida libre, miracidio y cercaria
(De Carvalho et al., 1998; Hassan et al., 2008).
El latex de Euphorbia milii Hislopii no produjo efectos
sobre los huevos del trematodo Schistosoma mansoni
Sambon, 1907 (De Carvalho et al., 1998). Hassan et al.
(2008) mostraron que el sulfato de cobre y la
niclosamida no produjeron efectos en la eclosión de los
huevos de Fasciola gigantica Kehlmaier, 2005. Sin
embargo, el superfosfato y el sulfato de amonio
presentaron un efecto inhibitorio en el desarrollo de los
huevos. Hegazi et al. (2007) han evaluado el propoleo de
abeja encontrando efectos inhibitorios en los huevos de
F. gigantica. En el presente estudio cuatro de los cinco
extractos ensayados no presentaron efectos ovicidas
sobre F. hepatica (Tabla 2).
DISCUSIÓN
Tabla 1. Tamizaje fitoquímico de los extractos hexánico, clorofórmico e
hidroalcohólico de la corteza y hoja de Paullinia clavigera (Sapindaceae).
Corteza Hoja
Pruebas fitoquímicas hexánico clorofórmico hidroalcohólico hexánico clorofórmico hidroalcohólico
Alcaloides
Saponinas
Esteroides
Triterpenos
Taninos
Fenoles/antocianidinas
Flavonoides
Cumarinas
Quinonas
Aminoácidos
-
-
-
+
-
-
+
-
±
ND
-
±
+
-
-
-
+
+
±
ND
-
+
-
-
-
+
+
+
+
ND
-
ND
+
+
-
-
-
ND
-
-
-
ND
-
-
-
+
+
ND
-
+
-
ND
+
+
-
-
-
ND
-
-
Leyenda: reacción - = negativa. ± = muy poco positiva. + = positiva. ND = No determinado.
57
Efecto del Sacha Yoco en Fasciola hepatica Iannacone J, Alvariño L, Pérez D.
Tabla 2. Efecto de P. clavigera sobre la eclosión de huevos de F. hepatica.
% Eclosión
mg L-1
Extracto
Hexano
Corteza
Extracto
Cloroformo
Corteza
Extracto
Cloroformo
hoja
Extracto
Hidroalcohol
Corteza
Extracto
Hidroalcohol
Hoja
Control H O destilada
2
Control solvente
0,05
0,1
0,2
0,4
80,2a
76,2a
81,3a
80,2a
56,4b
50,1b
75,4a
78,5a
86,3a
73,4a
76,3a
74,9a
78,4a
80,3a
77,4a
78,7a
79,7a
81,6a
86,3a
89,1a
85,6a
88,6a
79,4a
83,1a
82,0a
90,2a
89,2a
83,9a
84,9a
80,1a
Letras minúsculas iguales en sentido vertical indican que los porcentajes de eclosión son estadísticamente iguales.
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En el caso de F. hepatica, el efecto del extracto hexánico
de corteza de sacha yaco tendría alta utilidad como
ovicida. Al evaluar si la corteza de P. clavigera tendría
efectos en los organismos no destinatarios de la biota
acuática, se ha observado resultados variables. Así el
extracto clorofómico de P. clavigera presentó el mayor
efecto en D. magna en comparación al extracto
hexánico. El extracto hidroalcohólico de P. clavigera
presentó el mas alto efecto en Ch. calligraphus.
Finalmente el extracto hexánico ocasionó la mayor
mortalidad en A. franciscana (Iannacone et al., 2007;
Iannacone & Pérez, 2008).
58
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Autor para correspondencia/Correspondence to
author:
José Iannacone,
Laboratorio de Invertebrados, Facultad de Ciencias
Biológicas,
Universidad Ricardo Palma.
Avenida Benavides 5440. Lima 33. Lima, Perú.
Correo electrónico/E-mail:
joseiannacone@gmail.com
Teléfono/Telephone: (51)-12573227
Telefax: (51)-12573227
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