Neotrop. Helminthol., 6(2), 2012
2012 Asociación Peruana de Helmintología e Invertebrados Afines (APHIA)
ISSN: 2218-6425 impreso / ISSN: 1995-1043 on line
ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL
1,2 1,3
Paul Iturbe Espinoza & Flavia Muñiz Pareja
1 Facultad de Ciencias Biológicas. Centro de Investigaciones Parasitológicas Regionales Inka-CIPRI Universidad Nacional de San Antonio Abad de Cusco
Av. La Cultura 733 Cusco
2 3
iturbe555@hotmail.com, fmpegog@yahoo.es
Suggested citation: Iturbe-Espinoza, P & Muñiz-Pareja, F. 2012. Galba truncatula induced to infection with miracidia of
Fasciola hepatica, collected in Huayllapampa - San jerónimo - Cusco, Peru. Neotropical Helminthology, vol. 6, N°2, pp. 211 -
217.
Resumen
Se cultivó caracoles limneidos Galba truncatula, obtenidos desde enero hasta abril de 2011,
procedentes de una biotopo sub urbano considerado hiperendémico, Huayllapampa del distrito de San
Jerónimo, Cusco, Perú, . Se les mantuvo en un medio acuático y se les infectó a 215 con miracidios de
Fasciola hepatica, obtenidos a partir de huevos tamizados y lavados en agua hervida enfriada
provenientes de vesícula y conductos biliares de tres ovinos con fasciolosis. Se incubaron a
temperatura constante de 26°C. La colecta de G. truncatula presentó una abundancia de captura por
unidad de esfuerzo (CPUE) de 150 caracoles / h. La merística de sus conchas fluctuó entre: 3,5 – 7 mm
de largo y 2,2 – 3,6 mm de ancho. La supervivencia fue de 75,81%, de los cuales 71,78% mostraron
infección con F. hepatica.
Palabras claves: cultivo - Fasciola hepatica - Galba truncatula - infección - miracidio.
Abstract
Keywords: culture - Fasciola hepatica - Galba truncatula - infection - miracidium.
Galba truncatula snails were obtained from January to April 2011, from a sub urban biotope
(Huayllapampa) district of San Jeronimo, Cusco, Peru, and considered hyperendemic. They were
grown in an aquatic environment. They were experimentally infected (n= 215) with miracidia of
Fasciola hepatica. The eggs were obtained from the gallbladder and bile ducts of three sheep with
fasciolosis, screened and washed in boiled water cooled to incubate at a constant temperature of 26°C.
The resulting collection of snails had an abundance of catch per unit effort of 150/h. Shells ranged
between: 3.5 to 7.0 mm long, 2.2 to 3.6 mm in width. A survival 75.81%, of which 71.78% showed
infection with F. hepatica was noted.
GALBA TRUNCATULA INDUCED TO INFECTION WITH MIRACIDIA OF FASCIOLA HEPATICA,
COLLECTED IN HUAYLLAPAMPA, SAN JERÓNIMO, CUSCO, PERU
GALBA TRUNCATULA INDUCIDA A INFECCIÓN CON MIRACIDIOS DE FASCIOLA HEPATICA,
COLECTADOS EN HUAYLLAPAMPA, SAN JERÓNIMO, CUSCO, PERU
211
Iturbe-Espinoza & Muñiz-Pareja
Galba truncatula with miracidia of Fasciola
Los limneidos son moluscos gasterópodos
pulmonados, que viven en las orillas de riachuelos,
abrevaderos, charcas, praderas inundadas, etc., es
decir, donde hay agua dulce de corriente lenta
(Carrada, 2007). La distribución de la fasciolosis
depende de la presencia de este caracol limneido
(Rodríguez et al., 1987) que sirve de hospedador
intermediario (Wilford, 1977), siendo susceptibles
a infecciones por miracidios de F. hepatica,
proveniente de huevos embrionados en el medio
ambiente y cuyas larvas eclosionadas a
temperaturas mayores a los 10°C, son guiadas por
el fototropismo positivo, geotropismo negativo y
quimiotactismo (Rojo & Ferré, 1999) a su
hospedador intermediario (limneido). Esta larva
ciliada posee una forma ovoide alargada, de unos
130 a 180 µm de largo (Athías, 1999), una papila
móvil también llamado órgano perforador o
terebratorium (Euzéby, 2001) y una glándula
apical, cuya secreción colabora en la dilución de
los tejidos en el proceso de penetración al
limneido, depositándole enzimas histolíticas
(Cordero del Campillo et al., 1999). Los
miracidios tienen un intestino rudimentario,
dependiendo completamente de las reservas
alimenticias endógenas; las que duran menos de 24
h, limitándoles su búsqueda del caracol
intermediario y causándoles entonces la muerte
(Cordero del Campillo et al., 1999); sin embargo
su capacidad para invadir a su hospedero
intermediario exitosamente es de 1,5 a 2 h
posteriores a su eclosión, declinando lentamente
esta capacidad (Ginetsinskaya, 1988), siendo la
penetración con movimientos rítmicos regulares
de contracciones y elongaciones de su cuerpo
haciéndose más exitosa en el área de la cavidad
pulmonar, probablemente porque el terebratorium
del miracidio es más largo que el espesor de este
epitelio, siendo menos exitosa en otras áreas que
son más gruesas (Ginetsinskaya, 1988).
Las larvas de F. hepatica dentro del caracol
ocasionan cambios histopatológicos que
interrumpen el normal desarrollo de los caracoles
hospedadores causándoles: liberación de hasta tres
veces más calor que los no infectados, incremento
de consumo del oxígeno, intensificación del
metabolismo y por ende incremento de su tamaño
(gigantismo) (Wilson & Denison, 1980;
Ginetsinskaya, 1988; Dalton, 1999), que coincide
INTRODUCCIÓN
con la migración del esporocisto a través de sus
tejidos (Thompson, 1997; Dalton, 1999), y alcanza
aproximadamente el doble de su tamaño,
habiéndose visto ello en en Galba truncatula (=
Lymnaea truncatula) (Müller, 1774) (Wilson &
Denison, 1980; Dalton, 1999), la destrucción del
tejido conectivo y de las glándulas digestivas
(Preveraud-Sindou et al., 1994). La presión de las
larvas en los tejidos causa la desaparición de la luz
de los túbulos (Ginetsinkaya, 1988).
En consecuencia, la hemolinfa rica en oxígeno no
llega a la glándula, resultando en anoxia y
subsecuente autolisis de la glándula digestiva,
junto a la acumulación de metabolitos de las larvas,
que inducen a la desintegración de la glándula
digestiva y a una substancial disminución del nivel
del glicógeno (Thompson, 1997), incrementando
así, el nivel de mortalidad de estos limneidos,
siendo oportuno investigarlos, en un medio
acuático, complementado con algas y otros
nutrientes, para generarles infección inducida con
miracidios de F. hepatica en laboratorio.
Los estudios sobre el cultivo de intermediarios de
Fasciola hepatica (Linnaeus, 1758) en el Perú, aún
son escasos, por lo que el objetivo de la presente
investigación fue realizar una colecta de limneidos
del distrito de San Jerónimo, del departamento del
Cusco, Perú e inducirlos infección con miracidios
en diseño experimental, manteniéndolos en
suficiente número y bajo condiciones controladas
en laboratorio.
Se colectaron caracoles de enero a abril del 2011 de
un curso de agua de uso agrícola, denominado
Rumitabla, ubicado a 13º 32' 21.9'' LS, 71º 52'
15,6'' LW y 3324 m de altitud (± 8 m), que
transcurre a través de una arboleda de Eucaliptus
globulus Labill correspondiente a Huayllapampa
zona suburbana, distrito de San Jerónimo,
próximo a la ciudad de Cusco, Perú. Se colectó
agua para la evaluación de las características
físico-químicas en el Laboratorio de Control de
Calidad de SEDACUSCO SA (Entidad Municipal
Prestadora de Servicios de Saneamiento). Se
efectuó la búsqueda visual de caracoles sobre el
substrato fijo o flotante en una superficie
2
determinada de un m , capturando el mayor
212
MATERIALES Y MÉTODOS
Neotrop. Helminthol., 6(2), 2012
213
número posible, haciendo uso de una pinza y se
trató de no dañar a los caracoles. Se estimó la
abundancia de caracoles, mediante la captura por
unidad de esfuerzo (CPUE) (Prepelitchi, 2009),
equivalente a 60 min de trabajo, e in situ
colocándolos en la palma de la mano enguantada
para constatar su orientación dextrógira. Se
pasaron uno a uno al recipiente plástico, con agua
del sitio de colecta, marbetados con la fecha y el
lugar de muestreo y se llevaron al Laboratorio de
Parasitología C-224 de la Facultad de Ciencias
Biológicas; situados en la Ciudad Universitaria de
Perayoc, Av. de la Cultura 733, Cusco, Perú, para
su observación microscópica y verificación de la
orientación dextrógira de la concha, su forma
globosa y carencia de opérculo (Llop et al., 2001),
más la merística conquilógica de 30 ejemplares
elegidos al azar: LC = Largo de concha, AC =
Ancho de concha, LA = Largo de abertura, AA =
Ancho de abertura y LE = Largo de espira (Bargues
et al., 2007). Posteriormente fueron introducidos
en un vial conteniendo alcohol etílico al 70% y
enviados al Laboratorio de Biología Marina y
Malacología de la Universidad de Perpignan,
Francia, para su identificación molecular,
correspondiendo según las observaciones hechas
por Pointier a G. truncatula. Para cumplir con el
tamaño muestral se consideró un nivel de
confianza del 95%, Z = 1,96, una precisión de 3%,
α
y el índice infección experimental de L. viatrix por
F. hepatica en Perú, que es del 70% de acuerdo a
Larrea et al. (2007), resultando 215 caracoles para
iniciar la inducción a infección que se cultivaron
en un acuario de 20 x 40 x 25 cm, con oxigenador
eléctrico y 3,5 L de agua declorada,
-1
complementada con nitrato a 0,13 g·L , calcio a
-1
0,92 g·L modificando la composición del sustrato
propuesto por Sánchez et al. (1995), fragmento de
roca, más algas de los géneros Oscillatoria
(Vaucher ex Gomont, 1892) y Spirogyra (Link,
1820) y plántulas de Nasturtium officinale (R. Br.
in W.T. Aiton, 1812) de su biotopo natural,
compensando la pérdida cada cuatro días, en
condiciones de temperatura y humedad del
ambiente del laboratorio, mensurando éstas con
termo-higrómetro digital, correspondiendo a
temperatura máxima de 22,7ºC, y mínima de
16,7ºC, humedad relativa promedio de 53%,
temperatura en el agua de 16,6 ± 1ºC. Se dispuso de
la iluminación natural que ingresa por las ventanas
del laboratorio, con fotoperiodo de 12 h, y
exposición a 3 h de luz solar directa.
Se descartaron los caracoles infectados
naturalmente, identificándolos por poseer mayor
tamaño (gigantismo) (Wilson & Denison, 1980;
Ginetsinskaya, 1988; Dalton, 1999), teniendo en
cuenta que los limneidos colectados provienen de
una zona hiperendémica de fasciolosis. Se
diseccionó 50 caracoles mediante la técnica de
Olazabal et al. (1999), que consiste en situar al
caracol en una placa Petri, añadir 3 mL de agua
corriente, comprimir al molusco con una pinza, y
con ayuda de agujas enmangada observar a
estereoscopía y microscopía los estadíos larvales
de F. hepatica en la masa interna del caracol, con
especial interés en el glándula digestiva, riñón y
gónadas. Hallándolos sólo en caracoles de más de 9
mm de longitud correspondiendo al 2% de
caracoles infectados en el biotipo de procedencia,
por lo que se utilizó caracoles limneidos de una
longitud menor, en el rango de 3,5 a 7 mm para ser
utilizados en la infección inducida.
Para la obtención de miracidios se siguió la
metodología utilizada por Iturbe & Muñiz (2010).
Se colectaron los huevos de F. hepatica de la
vesícula y el conducto biliar de tres hígados de
ovinos con fasciolosis, sacrificados en el Camal
Municipal de San Jerónimo, durante el mes de
enero del 2011, se tamizaron y se lavaron en agua
3
hervida enfriada, se colocaron 20 cm del
sedimento en cada placa Petri por triplicado, a una
temperatura constante de 26°C y en presencia de
una lámpara eléctrica de 25 watts encendida como
fuente de luz constante, agregando agua hervida
enfriada para su compensación.
A once días de incubación, próximo a la eclosión de
miracidios, los huevos de F. hepatica embrionados
fueron vistos en el microscopio estereoscópico y
con la ayuda de una jeringa descartable de 1 mL de
volumen con aguja de 0,40 x 13 mm, fueron
distribuidos en número de cinco por pocillo (Placa
Nummaxisorp - ELISA). Se observaron al día
siguiente la eclosión de los miracidios, ya
distribuidos en cada pocillo. Para facilitar la
infección los caracoles fueron estresados (Abrous
et al., 2001), sometiéndolos a agua fría (6ºC) por 15
min, luego fueron distribuidos individualmente
con ayuda de una pinza en cada pocillo, que
contenía a los miracidios de aproximadamente 1,5
h de eclosión (capacidad óptima del miracidio).
Para facilitar el contacto después de 2 h se verificó
Tabla 1. Merística de conchillas de Galba truncatula seleccionados para la infección con Fasciola hepatica.
Medidas (mm) Media ± error
estándar Desviación estándar Rango
Largo de concha (LC) 5,08±0,14 0,76 3,5 - 7
Ancho de concha (AC) 2,85±0,06 0,34 2,2 - 3,6
Largo de abertura (LA) 2,64±0,07 0,39 2,1 - 3,8
Ancho de abertura (AA) 1,74±0,04 0,21 1,4 - 2,3
Largo de espira (LE) 2,60±0,07 0,39 2 - 3,3
Tabla 2. Porcentaje de supervivencia de Galba truncatula post-infección sometidos a cultivo.
Frecuencia absoluta Frecuencia relativa (%)
Caracoles vivos 163 75,81
Caracoles muertos 52 24,19
Total de caracoles 215 100
Tabla 3. Porcentaje de infección experimental de Galba truncatula con miracidios de Fasciola hepatica.
Frecuencia absoluta Frecuencia relativa (%)
Caracoles infectados 117 71,78
Caracoles no infectados 46 28,22
Total de caracoles diseccionados 163 100
214
la ausencia de miracidios en cada pocillo, como
signo inequívoco de penetración en los caracoles.
De los 215 caracoles inducidos a infección,
mediante muestreo por destrucción uno a uno
fueron diseccionados cinco cada tres días,
observándolos a estereoscopia y microscopía,
simultáneamente (Olazabalet al., 1999), que
confirmó el número de caracoles infectados.
Simultáneamente se cuantificó y descartó a los
caracoles hallados muertos.
Las aguas del biotopo natural presentaron las
siguientes características fisicoquímicas:
turbiedad 3,25 NTU, color 6,4 UC, pH 7,7,
-1
alcalinidad 157,6 mg·L CaCO , dureza total 161,4
3
-1 -1
mg·L CaCO , calcio 44,4 mg·L , magnesio 12,1
3
-1 -1 -1
mg·L , cloruros 7,3 mg·L , sulfatos 110,6 mg·L ,
- 1
sólidos totales disueltos 238 mg·L y
-1
conductividad 470,0 uS·cm , consideradas
idóneas para el habitad de limneidos hospedadores
intermediarios de F. hepatica. El índice de
abundancia de CPUE fue de 150 caracoles por h
durante la tarde del día 12 de febrero del 2011,
colectando 400 caracoles.
Se observó las características conquiológicas
siguientes: concha globosa, sin opérculo de
orientación dextrógira (Fig. 1). Las merísticas se
muestran en la Tabla 1. De un total de 163 caracoles
hallados vivos (Tabla 2), observados a
estereoscopía y microscopía durante su disección
se obtuvo el porcentaje de infección experimental
(Tabla 3).
Durante la infección se evidenció que los
miracidios eran guiados mediante su
quimiotactismo al aglomerarse alrededor de los
caracoles, para luego sujetarse utilizando sus
papilas apicales e intentar penetrar al caracol
limneido mediante constricciones y elongaciones
de su cuerpo (Figs. 2 y 3).
RESULTADOS
Iturbe-Espinoza & Muñiz-Pareja
Galba truncatula with miracidia of Fasciola
215
Neotrop. Helminthol., 6(2), 2012
Figura 1. Características conquiológicas y merística de conchillas de Galba truncatula seleccionados para la infección con
Fasciola hepatica. Vista al M. estereoscópico, sobre papel milimetrado.
Figura 2. Infección podal en Galba truncatula por miracidios
de Fasciola hepatica vista estereoscópica. Figura 3. Penetración de miracidio por el manto de Galba
truncatula, vista estereoscópica.
216
Iturbe-Espinoza & Muñiz-Pareja
Galba truncatula with miracidia of Fasciola
Se hallaron caracoles limneidos en un biotopo del
sector de Huayllapampa, San Jerónimo (Cusco) en
área suburbana a 3224 m de altitud, con
condiciones físico-químicas óptimas constatadas
en el análisis practicado. En el Perú, se han descrito
tres especies de limneidos naturalmente infectados
con formas larvarias de F. hepatica: L. viatrix
(D'Orbigny, 1835), L. diaphana (King, 1830), L
columella (Say, 1817) y una facultativa L. cousini
(Jousseaume, 1887) (Larrea et al., 2007; Londoñe
et al., 2009). Se cuenta con varias zonas
hiperendémicas de distomatosis hepática en los
que no se conoce la especie de limneido
involucrado. En algunas localidades o regiones
donde pueden existir varios intermediarios no se
conoce cuál es el principal y cual el potencial. En el
biotopo de colecta se halló G. truncatula que
adquiere importancia en la dispersión geográfica y
colonización de nuevos biotopos de limneidos
introducidos en el Perú, pareciera por el sur desde
el altiplano de Bolivia ( 2001 en
Pointier et al., 2007).
Los estudios sobre aspectos biológicos y
ecológicos de limneidos en condiciones naturales
o experimentales en biotopos de Cusco son
escasos. En el presente estudio, la eficiencia para
el cultivo resultó en un 75,81%, menor a lo
reportado por Sánchez et al. (1995) en Cuba en
condiciones controladas con caracoles libres de
infección, donde obtienen 98 % de infectividad
para L. cubensis, diferencia debida probablemente
a la presencia del parásito inoculado y su
consecuente perjuicio metabólico en G.
truncatula. Bouix-Busson et al. (1983) utilizaron
en su máximo límite, cinco miracidios de F.
hepatica, más estrés térmico propuesto por
Abrouset al. (2001), resultando en 71,78 % de
infectados, menor a lo indicado por Abrous et al.
(2001), que obtiene 94,5 %, y comparativamente
similar a los obtenidos por Mas-coma et al. (2001),
cuyos resultados de infección in vitro fueron
69,2%, pero sin someterlos a estrés térmico. Los
limneidos presentan un mejor desarrollo en
depósitos acuáticos ricos en algas, y en arroyos
claros que en medios secos y fríos, por lo que según
Quiroz (2003) se les dotó de berro (N. officinale) y
de algas (Spyrogira y Oscillatoria) provenientes
de su mismo biotopo natural. Por su morfología, la
especie estudiada correspondió a G. truncatula, lo
Meunier et al.,
DISCUSIÓN que se confirmó por la prueba molecular. Este es el
primer reporte de G. truncatula para la zona de
Cusco, Perú.
A Jean Pierre Pointier por su apoyo incondicional
en la identificación G. truncatula.
AGRADECIMIENTO
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Paul Iturbe Espinoza
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de Cusco. Av. La Cultura 733 Cusco, Perú.
E-mail/ correo electrónico:
iturbe555@hotmail.com
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